周 淼， 李風(fēng)雷， 孫俊波

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科， 河南 鄭州 450000； 2河南省中醫(yī)院， 河南 鄭州 450002)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是過(guò)多的纖維膠原沉積在肺間質(zhì)內(nèi)的一種慢性進(jìn)行性疾病，其主要特征表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞因子的積累，成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量沉積等，其發(fā)病過(guò)程和機(jī)制尚不明確。近年來(lái)大量研究表明氧化與抗氧化作用失衡引發(fā)的氧化應(yīng)激是IPF發(fā)病的主要機(jī)制之一。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF-21)屬于FGF家族成員之一。它通過(guò)抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[1-3]。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)FGF-21通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)保護(hù)小鼠肝臟免受D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[4]。此外，F(xiàn)GF-21通過(guò)激活Nrf2抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表明FGF-21具有抗炎作用[5]。FGF-21通過(guò)下調(diào)纖維化因子IV型膠原蛋白、纖溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)進(jìn)而抑制腎纖維化[6]。但是FGF-21在博萊霉素(bleomycin,BLM)所致的肺纖維化中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題擬采用氣管內(nèi)滴注BLM的方法建立小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，探討FGF-21和Nrf2對(duì)BLM誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激所致的小鼠肺間質(zhì)纖維化的作用，并進(jìn)一步探討其對(duì)肺間質(zhì)纖維化相關(guān)分子作用機(jī)制的影響，以期尋求新的治療策略。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

博萊霉素購(gòu)自日本化藥株式會(huì)社；BCA購(gòu)自Beyotime；PVDF膜購(gòu)自Merk millipore；抗I型膠原蛋白(collagen I)、纖連蛋白(fibronectin)、Nrf2和GAPDH抗體購(gòu)自Sigma；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase，GPx)及羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和TGF-β1的ELISA試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司；Nrf2-siRNA(Si-Nrf2)和陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, si-NC)慢病毒載體購(gòu)自南京凱基生物公司。

2 方法

2.1動(dòng)物模型構(gòu)建及分組處理 40只昆明小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)提供，許可證號(hào)為SKXY(陜)2014-001，隨機(jī)分為5組，即對(duì)照(control)組、BLM組及不同劑量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)處理組。將BLM溶于無(wú)菌生理鹽水中，對(duì)各組小鼠進(jìn)行水合氯醛麻醉后，對(duì)除正常對(duì)照組外其余組以3 mg/kg的劑量對(duì)其進(jìn)行氣管內(nèi)滴注，制作小鼠肺損傷模型，正常對(duì)照組小鼠則滴注等量生理鹽水。然后根據(jù)分組情況腹腔注射不同劑量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)，每天1次，連續(xù)21 d；另取小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射1×108PFU的si-Nrf2慢病毒載體和si-NC空載體，隔天注射一次。最后一天處死小鼠，留存小鼠肺組織及血清樣本。本研究中的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程均應(yīng)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

2.2Western blot檢測(cè)蛋白水平 取0.1 g肺組織，勻漿后抽提總蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。取20 μg蛋白行10% SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗collagen I、fibronectin和Nrf2抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加入 II 抗(HRP標(biāo)記)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光自顯影。以目的蛋白條帶密度與GAPDH條帶吸光度比值表示目的蛋白的相對(duì)水平。

2.3肺組織ROS含量的檢測(cè) 取不同處理組小鼠肺組織勻漿4 μL，加入396 μL PBS稀釋100倍。取100 μL稀釋液于酶標(biāo)板中排列，并加入100 μL熒光染料DCFA染色，避光反應(yīng)5 min，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。

2.4抗氧化指標(biāo)MDA、SOD和GPx的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)不同處理組肺組織中MDA含量及SOD和GPx活性。

2.5ELISA檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)水平 采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)不同處理組肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6HYP含量的檢測(cè) 不同處理組小鼠肺組織勻漿后取上清，然后根據(jù)HYP測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FGF-21抑制BLM誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答

與control組相比，BLM組TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高(P<0.05)，而相對(duì)于BLM組，F(xiàn)GF-21明顯降低這些炎癥因子的分泌水平，且呈劑量依懶性(P<0.05)，表明FGF-21能夠減輕IPF過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of FGF-21 on BLM-induced inflammatory response. The levels of inflammatory mediators TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

2 FGF-21抑制BLM誘導(dǎo)的氧化損傷

相比control組，BLM組胞內(nèi)ROS的含量顯著增加(P<0.05)，而經(jīng)FGF-21處理后，ROS的產(chǎn)生明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。BLM組肺組織中MDA含量顯著升高，經(jīng)過(guò)FGF-21處理后，肺組織中MDA的含量明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖2B。BLM組SOD和GPx的活性較control組顯著降低(P<0.05)，而FGF-21處理后明顯增加SOD和GPx的活性(P<0.05)，見(jiàn)圖2C、2D。這些結(jié)果提示FGF-21防治肺纖維化的作用可能與提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)。

Figure 2.The effect of FGF-21 on BLM-induced oxidative stress. A: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining; B, C and D: the content of MDA and the activity of SOD and GPx were detected by commercially available kits. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs BLM group.

3 FGF-21降低BLM誘導(dǎo)的胞外基質(zhì)分泌

BLM組肺組織中的collagen I和fibronectin蛋白水平較control組顯著上調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)GF-21處理組肺組織中這2種蛋白的表達(dá)較BLM組明顯下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3A。 BLM組肺組織中TGF-β1的表達(dá)水平相比control組增高(P<0.05)，F(xiàn)GF-21處理后其表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。此外， BLM組中HYP的含量顯著高于control組，而FGF-21處理明顯減少HYP含量(P<0.05),見(jiàn)圖3C。

4 Nrf2信號(hào)參與調(diào)控FGF-21的抗肺纖維化作用

與BLM組相比，F(xiàn)GF-21明顯上調(diào)Nrf2的表達(dá)水平(P<0.05)，表明FGF-21能夠激活Nrf2信號(hào)通路，見(jiàn)圖4A。沉默Nrf2的表達(dá)明顯恢復(fù)炎癥因子IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖4B，并增加了ROS的產(chǎn)生(P<0.05)，見(jiàn)圖4C，說(shuō)明沉默Nrf2的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)FGF-21介導(dǎo)的抗炎作用及抗氧化應(yīng)激作用，提示FGF-21可能通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá)、增加Nrf2活性而減輕BLM所致的肺纖維化。

Figure 3.The effects of FGF-21 on BLM-induced extracellular matrix production. A: Western blot analysis was used to determine the protein expression of collagen I and fibronectin; B: the expression level of TGF-β1 was measured by ELISA; C: the content of HYP was measured by commercially available kit. Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

Figure 4.FGF-21 suppressed BLM-induced pulmonary fibrosis by activating Nrf2. A: the protein expression of Nrf2 was determined by Western blot; B: the levels of inflammatory mediators IL-1β and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA; C: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group; &P<0.05 vs FGF-21+BLM+si-NC group.

討 論

博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型早期主要表現(xiàn)為肺泡炎癥，繼而出現(xiàn)成纖維細(xì)胞異常增生及細(xì)胞外基質(zhì)形成增多和沉積，最終出現(xiàn)肺纖維化。本研究采用氣管內(nèi)滴注BLM的方法建立小鼠特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化模型。

肺纖維化發(fā)病過(guò)程中，肺組織中的中性粒細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6，破壞機(jī)體內(nèi)炎癥系統(tǒng)/抗炎系統(tǒng)之間的平衡，從而破壞正常的肺組織結(jié)構(gòu)[7-8]。在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高；經(jīng)FGF-21處理后，肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯降低，該結(jié)果表明FGF-21防治肺纖維化的作用可能與其抗炎能力有關(guān)。

氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致和促進(jìn)肺纖維化病理進(jìn)程的一個(gè)重要因素，是IPF的重要發(fā)病機(jī)制[9]。ROS在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程中扮演重要角色。越來(lái)越多證據(jù)表明BLM誘導(dǎo)肺纖維化是由于BLM能夠促進(jìn)ROS產(chǎn)生，增加氧化物負(fù)擔(dān)，使得肺內(nèi)氧化物、抗氧化物失衡。MDA是自由基作用于脂質(zhì)后發(fā)生或氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物；SOD是一種重要的內(nèi)源性抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用。GPx是清除H2O2與有機(jī)過(guò)氧化物的重要抗氧化酶。有研究發(fā)現(xiàn)氧化損傷可降低FGF-21的表達(dá)量，表明FGF-21與氧化應(yīng)激存在一定的關(guān)系[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中，ROS生成及MDA含量顯著升高，且SOD和GPx等抗氧化酶活性均顯著降低，提示肺組織發(fā)生增強(qiáng)的氧化應(yīng)激，使脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多；FGF-21處理后能夠明顯逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。綜合上述結(jié)果表明FGF-21緩解BLM造成的肺纖維化，可能與抑制自由基過(guò)氧化物的生成、增加抗氧化酶活性進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮其抗纖維化的作用。

TGF-β1能介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的趨化、增殖及分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、聚集及減少細(xì)胞外基質(zhì)降解等效應(yīng)，被認(rèn)為是肺纖維化過(guò)程最關(guān)鍵細(xì)胞因子。HYP是膠原的降解產(chǎn)物，可作為BLM誘導(dǎo)肺纖維化病變的重要指標(biāo)。該結(jié)果表明FGF-21減少BLM誘發(fā)的肺纖維化的間質(zhì)膠原沉積，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，并降低肺內(nèi)的HYP的含量而起到抗纖維化的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在IPF中低表達(dá)，且Nrf2激活能夠增加抗氧化防御及肌纖維母細(xì)胞的去纖維化[11]。此外，F(xiàn)GF-21通過(guò)減少腎脂積累和抑制炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化，從而緩解了FFA及糖尿病引起的腎損害[12]。另有研究表明Nrf2能夠正調(diào)控FGF-21的表達(dá)[13]。與前期研究結(jié)果一致，在纖維化小鼠模型中，F(xiàn)GF-21能夠激活Nrf2信號(hào)，更為重要的Nrf2沉默能夠阻斷FGF-21的抗炎及抗氧化應(yīng)激作用，表明Nrf2參與FGF-21介導(dǎo)的抗纖維化保護(hù)效應(yīng)。