周 楊， 趙再華， 沈?qū)W鋒， 駱文靜， 曹子鵬

(第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊(duì)勞動(dòng)與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室， 特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710032)

高原低壓低氧環(huán)境對(duì)人體的影響涉及多個(gè)系統(tǒng)和器官，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是大腦對(duì)低氧極為敏感[1-3]。長期處于低壓低氧易出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，并導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[4]。海馬作為大腦最敏感、最具有可塑性的功能區(qū)，在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要的作用[5]。低壓低氧暴露會(huì)影響神經(jīng)元NMDA受體表達(dá)，使海馬神經(jīng)元興奮性降低，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，但其分子機(jī)制尚不完全明確[6]。樹突棘是神經(jīng)元樹突上的突起結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)具有高度的可塑性，對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能以及認(rèn)知過程至關(guān)重要[7]。細(xì)絲蛋白A(filamin-A)是高分子質(zhì)量細(xì)胞骨架蛋白細(xì)絲蛋白的亞型結(jié)構(gòu)，可與多種細(xì)胞骨架蛋白和信號(hào)蛋白結(jié)合，具有整合細(xì)胞力學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[8-9]。本研究通過模擬高原低氧環(huán)境觀察慢性低壓低氧暴露對(duì)小鼠樹突棘形態(tài)和細(xì)絲蛋白A表達(dá)的影響，為進(jìn)一步深入了解高原低氧環(huán)境影響認(rèn)知功能的機(jī)制進(jìn)行了探索。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物分組

C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，起始體質(zhì)量18～20 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(陜)2014-002。小鼠在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適宜條件下飼養(yǎng)適應(yīng)4 d后，隨機(jī)分為4組：常氧暴露7 d (normoxia 7 d)組、常氧暴露14 d (normoxia 14 d)組、低壓低氧暴露7 d (hypoxia 7 d)組和低壓低氧暴露14 d (hypoxia 14 d)組，每組20只。

2 主要儀器和試劑

低壓低氧小動(dòng)物模擬實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)；VT1000S 振動(dòng)切片機(jī)(Leica)；CM1900 冰凍切片機(jī)(Leica)；超聲裂解儀(Sonics & Materials)；蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU)；凝膠成像儀(Bio-Rad)；BX51 熒光顯微鏡(Olympus)。FD快速高爾基染色劑(FD Neurotechnologies)；二甲苯(國產(chǎn)分析純)；無水乙醇(國產(chǎn)分析純)；5×Buffer緩沖液、RIPA中效組織裂解液和DAPI染色試劑(上海碧云天)； BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；Tween-20(Sigma)；化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce)；中性樹酯膠和抗β-actin抗體(Sigma)；抗細(xì)絲蛋白A抗體(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(中國康為試劑公司)；PVDF膜(Millipore)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA; MP Biomedicals)；Triton X-100試劑(中國科昊生物公司)。

3 主要方法

3.1低壓低氧暴露小鼠模型 方法同文獻(xiàn)[10]，低壓低氧暴露組小鼠置于低壓低氧小動(dòng)物模擬實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)暴露，期間小鼠自由飲水，正常飼料喂養(yǎng)。模擬海拔高度為6 000米，分別連續(xù)暴露7 d 和14 d。

3.2Golgi染色 小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)麻醉后開胸，經(jīng)主動(dòng)脈灌注37 °C生理鹽水沖洗小鼠體內(nèi)血液，再以4%多聚甲醛灌注至肢體僵硬。取完整腦組織浸泡在高爾基液(A∶B=1∶1)中避光常溫放置2～3周。用振動(dòng)切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(厚100 μm)。切片分別經(jīng)蒸餾水漂洗，高爾基液(D∶E∶蒸餾水=1∶1∶2)浸泡，去離子水再次漂洗，50%、75%、95%和100%無水乙醇依次脫水，最后二甲苯透化，樹膠封片劑封片。

3.3樹突分支及樹突棘密度和長度的測定

3.3.1樹突的分支及長度 在光學(xué)顯微鏡200倍鏡下采集大鼠海馬CA1區(qū)Golgi染色圖片，利用Imaris軟件對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行重構(gòu)和Sholl分析，以神經(jīng)元胞體為圓心，做間距為20 μm的同心圓，統(tǒng)計(jì)樹突與同心圓的交點(diǎn)數(shù)之和，用交點(diǎn)總數(shù)反映樹突的分支。

3.3.2樹突棘分類及計(jì)數(shù) 在光學(xué)顯微鏡1 000倍鏡下觀察樹突棘，用Imaris軟件對(duì)神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行重構(gòu)并計(jì)數(shù)，以每10 μm樹突棘個(gè)數(shù)反映其密度。

3.4Western blot方法 方法同文獻(xiàn)[10]。小鼠麻醉后開胸，生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈灌注后取腦組織，輕輕剝離海馬置于1.5 mL的EP管中，每1 mg組織10 μL的比例加裂解液。充分研磨組織，靜置樣品于冰上充分裂解15 min，超聲裂解儀進(jìn)一步裂解(時(shí)間30 s、振幅25%)，離心(12 500 r/min，15 min)，定量后加入5×SDS樣品緩沖液，煮沸。每組樣品按40 μg蛋白上樣，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5% BSA室溫封閉2 h，加入I抗4 ℃孵育過夜。次日PBST洗膜，后加相應(yīng)II抗，室溫孵育2 h，再次PBST洗膜后小心滴加化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像儀成像并觀察拍照，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照(β-actin)積分吸光度(IA)的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3.5免疫熒光染色 小鼠麻醉后開胸，生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈灌注，4%多聚甲醛灌注至肢體僵硬后取完整腦組織。蔗糖溶液梯度脫水2～3 d，冰凍切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(厚20 μm)，晾干(室溫2 h)后PBS洗片3次,每次5 min，5% BSA(含0.3% Triton X-100)溶液室溫封閉透化30 min，將 I 抗用1% BSA溶液稀釋(1∶100)，滴加在封閉好的玻片上，放入濕盒中4 °C過夜。次日用PBS洗片3次,每次5 min，將熒光 II 抗用1% BSA溶液稀釋(1∶500)，小心滴加在玻片上，室溫下避光孵育2 h，PBS洗片3次,每次5 min，加入DAPI試劑染胞核，室溫下避光30 min，PBS洗片3次,每次5 min，70%甘油避光封片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraphPad Prism 5軟件作圖。

結(jié) 果

1 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)樹突分支的變化

神經(jīng)元樹突分支在接受信息傳入和反饋回路形成中起著重要作用[11]。我們采用Golgi染色法觀察慢性低壓低氧暴露對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突分支的影響，并用Imaris軟件對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示,與常氧暴露組相比，低壓低氧暴露7 d與14 d后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突分支數(shù)略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1。

Figure 1.Effect of hypobaric hypoxia exposure on branches of dendrites in the neurons of mouse hippocampal CA1 region. A: Golgi staining of mouse hippocampus (scale bar=100 μm); B: Golgi staining of mouse pyramidal neurons in hippocampus CA1 region (scale bar=50 μm); C: total number of intersection points of dendrites in hippocampal CA1 region after 7 d and 14 d of exposure. Mean±SD. n=6.

2 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)樹突棘密度及長度的變化

為了進(jìn)一步探討低壓低氧暴露對(duì)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的影響，將Golgi染色片在顯微鏡下觀察，采用Imaris軟件采集神經(jīng)元樹突棘圖片并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，與常氧暴露組相比，低壓低氧暴露7 d 與14 d后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元基樹突棘和頂樹突棘的密度均顯著減少(P<0.01)，并且樹突棘長度增加(P<0.05),見圖2。

3 慢性低壓低氧暴露后海馬組織細(xì)絲蛋白A表達(dá)的變化

通過Western blot法檢測低壓低氧暴露后小鼠海馬區(qū)細(xì)絲蛋白A的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,低壓低氧暴露7 d和14 d后，小鼠海馬組織細(xì)絲蛋白A的蛋白表達(dá)水平低于常氧暴露組(P<0.01或P<0.05)。與低壓低氧暴露7 d 組相比，暴露14 d 組細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平升高(P<0.05)，表明隨著低壓低氧暴露時(shí)間延長，細(xì)絲蛋白A的表達(dá)水平有一定程度的恢復(fù),見圖3。

Figure 2.Effect of hypobaric hypoxia exposure on dendritic spine density and length in the neurons of mouse hippocampal CA1 neurons. A: basal dendrites and dentritic spines (Golgi staining, ×1 000, scale bar=10 μm); B: apical dendrites and dentritic spines (Golgi staining, ×1 000, scale bar=5 μm). Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs normoxia group.

4 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布的變化

為了明確低壓低氧暴露對(duì)海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布的變化，采用免疫組織熒光染色法檢測低壓低氧暴露后小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布。結(jié)果顯示,細(xì)絲蛋白A在小鼠海馬CA1區(qū)有正常表達(dá)，低壓低氧暴露7 d 和14 d 后表達(dá)水平低于常氧暴露組(P<0.05)。與低壓低氧暴露7 d組相比，暴露14 d 組細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，這可能是由于免疫組織熒光染色實(shí)驗(yàn)中固定切片引起少部分抗原被封閉，導(dǎo)致檢測的敏感性下降[12],見圖4。

Figure 3.The effects of hypobaric hypoxia exposure on expression of filamin-A in mouse hippocampus. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs normoxia group; #P<0.05 vs hypoxia 7 d group.

Figure 4.The distribution of filamin-A in mouse hippocampal CA1 region. The scale bars are 100 μm in the upper pannel and 20 μm in the lower panel. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs normoxia group.

討 論

研究表明，慢性高原低氧可以影響大/小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[13-14]。缺氧對(duì)不同部位的腦神經(jīng)有不同的敏感性，其中海馬CA1錐體神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、丘腦網(wǎng)狀神經(jīng)元和腦干神經(jīng)元更易受到缺氧的干擾，這些神經(jīng)元被稱為“缺氧易感細(xì)胞(anoxia-prone cells)”[15-16]。而工作記憶功能易發(fā)生慢性損傷主要是由于海馬椎體CA1細(xì)胞對(duì)低氧有極高的敏感性。目前對(duì)低壓低氧環(huán)境暴露對(duì)大腦認(rèn)知功能影響的研究多局限于功能可塑性以及學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試，關(guān)于結(jié)構(gòu)可塑性的研究較少。樹突棘作為神經(jīng)元樹突的重要特征性結(jié)構(gòu)，其形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)神經(jīng)元信息傳遞和接收有重要的意義[17-18]。本研究采用Golgi染色方法觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果表明慢性低壓低氧暴露對(duì)神經(jīng)元交叉點(diǎn)數(shù)目無顯著影響，但低壓低氧暴露后CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度下降，長度增加。Segura等[19]利用原代培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元觀察低氧暴露對(duì)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)低氧暴露后樹突棘密度降低，長度增加，且無膨突偽足狀樹突棘比例增加。由此可見，低氧暴露可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的改變，提示樹突棘結(jié)構(gòu)改變可能與低氧暴露導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷有關(guān)。

細(xì)絲蛋白A是細(xì)胞骨架蛋白細(xì)絲蛋白的亞型結(jié)構(gòu)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，參與維持神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)和功能[20]。以往研究表明細(xì)絲蛋白A參與樹突形態(tài)發(fā)生[21]，軸突生長錐形成[22]和神經(jīng)元遷移[23]。在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，改變細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平可影響樹突棘的結(jié)構(gòu)[19]。本研究通過Western blot和免疫組織熒光染色方法檢測慢性低壓低氧暴露對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示慢性低氧暴露導(dǎo)致細(xì)絲蛋白A表達(dá)降低，說明細(xì)絲蛋白A可能與低氧暴露引起海馬CA1區(qū)樹突棘結(jié)構(gòu)損傷的過程有關(guān)，是低氧損傷學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制之一。Western blot結(jié)果顯示，低壓低氧暴露14 d 后細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平有一定程度恢復(fù)，而此時(shí)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘的密度和長度與暴露7 d 組無明顯差異，因此推測可能還有其它分子參與了低壓低氧暴露導(dǎo)致的樹突棘結(jié)構(gòu)改變。以上結(jié)果提示，需進(jìn)一步深入研究樹突棘結(jié)構(gòu)改變?cè)诘蛪旱脱踔聦W(xué)習(xí)記憶功能改變中的確切作用及其分子機(jī)制。

綜上所述，慢性低壓低氧暴露可導(dǎo)致小鼠海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)改變，密度降低且長度增加，并影響CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A的正常表達(dá)，提示細(xì)絲蛋白A表達(dá)降低可能與慢性低壓低氧暴露影響CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響小鼠學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)。