海廣范， 張 慧， 馬 敬， 郭蘭青， 王海燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2第二附屬醫(yī)院， 3護(hù)理學(xué)院， 4第一附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

惡性腫瘤是由于各種原因?qū)е录?xì)胞生長(zhǎng)和增殖失控而誘發(fā)的一種疾病，其發(fā)病率和死亡率均呈上升態(tài)勢(shì)[1]，肝細(xì)胞癌是發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤之一[2]，而對(duì)肝癌的治療尚缺乏安全有效的藥物。目前發(fā)現(xiàn)一些植物性抗腫瘤藥對(duì)肝癌具有較好的防治作用，并且具有不良反應(yīng)少、安全有效等特點(diǎn)，因此，植物性抗腫瘤藥成為科研工作者的研究熱點(diǎn)。溪黃草為唇形科(Labiatae)香茶菜屬 (Isodon)植物，具有涼血散瘀、退黃去濕和清熱解毒等功效，nodosin是從溪黃草中提取出來的貝殼杉烷型二萜化合物。 我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)nodosin對(duì)HepG2、HL60、LoVo、SGC7901和U87等多種細(xì)胞都有一定程度的抑制作用[3]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。鑒于大多數(shù)植物性提取藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用密切相關(guān)，我們以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討nodosin對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，為研發(fā)新的治療肝癌的藥物提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑材料

新生小牛血清購自鄭州博興生物科技有限公司；DMSO和Hoechst 33258購自廣州威佳生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液購自GIBCO；抗caspase-3抗體購自Santa Cruz; nodosin由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，高效液相色譜法測(cè)定其純度為95.5%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室提供，在-196 ℃液氮中凍存，由本實(shí)驗(yàn)室體外傳代培養(yǎng)。按照貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)方法把HepG2細(xì)胞于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每2 d換液1次，3 d左右傳代1次。

2.2熒光染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按照每孔3×105的細(xì)胞量把細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、 2.5、 5、 10和20 μmol/L，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(control)組，24 h后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗后加入10 μg/L Hoechst 33258染色10 min，PBS沖洗后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.3電鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按照每孔3×106的細(xì)胞量把細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為2.5、5和10 μmol/L，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，24 h后收集細(xì)胞，在4 ℃ 4%戊二醛溶液中固定4 h，然后用磷酸緩沖液洗滌24 h，用鋨酸固定液固定1 h，磷酸緩沖液洗滌2次，然后依次用50%、70%、80%、90%、95%和100%的丙酮梯度脫水，每次10 min，再用樹脂812浸透24 h，定向包埋聚合96 h，Leica UC6超薄切片機(jī)切成50 nm超薄切片，再用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，日立H-7500透射電鏡觀察、拍照。

2.4凋亡率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按照每孔2×106的細(xì)胞量把細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、 2.5、5、10和20 μmol/L，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，24 h后收集細(xì)胞，PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5RT-qPCR檢測(cè)凋亡蛋白酶激活因子1(apopto-tic protease-activating factor-1, Apaf-1) mRNA的表達(dá) 用1.25、2.5、 5、10和20 μmol/L的nodosin共培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照HepG2細(xì)胞組，24 h后收集細(xì)胞，提取RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶和引物合成cDNA, 反應(yīng)條件： 94 ℃變性40 s、61 ℃復(fù)性40 s、70 ℃延伸60 s，共32個(gè)循環(huán)。Apaf-1的上游引物序列為 5’-TTGCTGCCCTTCTCCATGAT-3’,下游引物序列為 5’-TCCCAACTGAAACCCAATGC-3’,內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-3’，下游引物序列為5’-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為490 bp。PCR條件： 93 ℃變性； 93 ℃ 60 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 2 min順序循環(huán)30次； 72 ℃延伸10 min。

2.6Western blot 檢測(cè)pro-caspase-3、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平 將經(jīng)2.5、5和10 μmol/L nodosin處理24 h后的HepG2細(xì)胞提取蛋白，并用SDS-PAGE辨別pro-caspase-3和caspase-3蛋白，然后以3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙的順序排好，4 ℃、 300 mA條件下轉(zhuǎn)移100 min，然后取出PVDF膜用PBS洗膜3次，用含有5%脫脂奶粉的PBS封閉60 min，用PBS緩沖液將PVDF膜洗3次后,用anti-pro-caspase-3、anti-caspase-3和anti-cleaved caspase-3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗膜2次并用羊抗鼠IgG-HRP(1∶100)室溫緩慢振蕩1.5 h后，PBS洗膜2次后顯色，并拍照記錄。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用方差分析進(jìn)行組間差異比較，并使用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熒光染色結(jié)果

陰性對(duì)照組HepG2細(xì)胞胞核染色均勻，細(xì)胞核飽滿； nodosin處理后細(xì)胞染色出現(xiàn)染色不均勻，細(xì)胞核出現(xiàn)切跡或者不規(guī)則的形狀，該形態(tài)在1.25和2.5 μmol/L 劑量組較為明顯，隨著用藥劑量的增加，在5、10和20 μmol/L劑量組可見細(xì)胞核濃縮成小塊狀，凋亡小體清晰可見，見圖1。

Figure 1.The effect of nodosin at different concentrations on the HepG2 cells observed by microscopy with Hoechst 33258 staining (×200).

2 電鏡觀察結(jié)果

電鏡觀察可見，未用nodosin處理過的細(xì)胞飽滿，細(xì)胞核圓潤(rùn)，核仁居中； 2.5 μmol/L nodosin處理過的細(xì)胞形態(tài)不均，細(xì)胞核出現(xiàn)切跡；5 μmol/L 劑量組細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、邊集，呈新月形，核膜皺褶，細(xì)胞器集中，細(xì)胞核呈現(xiàn)月牙形，核仁偏移；10 μmol/L 劑量組細(xì)胞胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡，凋亡小體清晰可見，見圖2。

3 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)結(jié)果

不同濃度nodosin對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響示,陰性對(duì)照組、1.25 μmol/L 劑量組、2.5 μmol/L 劑量組、5 μmol/L劑量組、10 μmol/L 劑量組和 20 μmol/L 劑量組凋亡率隨著nodosin濃度的增加凋亡率隨之增加(P<0.05或P<0.01),見圖3。

4 Nodosin對(duì)Apaf-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

與陰性對(duì)照組相比，Apaf-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在5 μmol/L劑量組、10 μmol/L 劑量組和 20 μmol/L 劑量組顯著增加(P<0.05),見圖4。

Figure 2.The effect of nodosin at different concentrations on the HepG2 cells observed under electron microscope.

5 Nodosin對(duì)caspase-3蛋白水平的影響

不同濃度nodosin作用于HepG2細(xì)胞24 h后，用Western blot法檢測(cè)caspase-3的蛋白水平。結(jié)果顯示，pro-caspase-3和caspase-3的蛋白水平逐漸增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(P<0.05或P<0.01)。Cleaved caspase-3的蛋白水平隨著nodosin濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

討 論

肝癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，肝癌的治療主要依賴于手術(shù)和化療藥物的應(yīng)用，但目前患者所使用的化療藥物，選擇性較差，作用范圍廣泛，副作用較多，并且腫瘤細(xì)胞耐藥性日益嚴(yán)重，因此，新型高效低毒抗腫瘤藥物的開發(fā)和研究，日益受到重視。

中藥作為中華民族的魂寶，具有毒性作用小、調(diào)理作用強(qiáng)和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，因此，中藥對(duì)腫瘤的治療和預(yù)防作用日益受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。香茶菜屬植物具有廣泛的抗腫瘤活性，如肝癌、胃癌和白血病等，溪黃草作為香茶菜屬植物也具有類似的抗腫瘤特性。已有大量的資料證明，該類植物除了具有抗菌、消炎和抗風(fēng)濕等作用外，還能明顯地縮小多種實(shí)體瘤的體積，具有防病、治病腫瘤的功效。Nodosin屬于二萜類化合物，是溪黃草的重要抗癌活性成分[4]，在前期研究報(bào)道中nodosin具有良好的拮抗HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的活性[5]。Nodosin的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為剛性骨架的四環(huán)二萜，具有不飽和環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果明顯。Nodosin對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

Figure 3.The effect of nodosin at different concentrations on the apoptotic rates of HepG2 cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L.

Figure 4.The effect of nodosin at different concentrations on the mRNA expression of Apaf-1 in the HepG2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種自然生理學(xué)過程，這種死亡方式受到生理或者病理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)特定基因操縱和調(diào)控，因此又稱為程序性細(xì)胞死亡[6]。凋亡小體的形成是細(xì)胞凋亡的主要特征之一。本論文中熒光顯微鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示,不同濃度nodosin作用于HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核偏移，細(xì)胞核呈現(xiàn)新月形，凋亡小體清晰可見，并且凋亡細(xì)胞數(shù)量隨著nodosin濃度的增加而增加，提示nodosin對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示， HepG2細(xì)胞的凋亡率隨著nodosin濃度的增加而增加，進(jìn)一步提示nodosin對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡的途徑主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑[7-8]，上述2個(gè)途徑的共同終末途徑是caspase家族蛋白[9]。Apaf-1[10]在線粒體途徑中發(fā)揮重要作用，它與細(xì)胞色素C和dATP形成凋亡小體，進(jìn)而切割caspase-9前體，使其激活pro-caspase-3轉(zhuǎn)變?yōu)閏aspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Apaf-1 mRNA表達(dá)增加，提示其切割功能的增強(qiáng)，pro-caspase-3 和caspase-3表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而增加，提示nodosin誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡最終激活了凋亡的終端途徑，而該效應(yīng)的發(fā)揮與Apaf-1的激活密切相關(guān)。在前期研究中我們還發(fā)現(xiàn)，nodosin可以通過增加Bax的表達(dá)，減少Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡[11]。Bcl-2和Bax是線粒體途徑中的2個(gè)調(diào)控因子，因而證實(shí)了nodosin對(duì)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用是通過內(nèi)源性途徑即線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。本次研究結(jié)果與前期研究結(jié)果一致。但nodosin是否在激活內(nèi)源性途徑同時(shí)激活外源性細(xì)胞凋亡途徑，尚需進(jìn)一步研究。

Figure 5.The effects of nodosin at different concentrations on the protein levels of pro-caspase-3, caspase-3 and cleaved caspase-3 in the HepG2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L.