梁君偉， 方志華， 李青山△

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科， 2承德市第三醫(yī)院胸腹外科，河北 承德 067000)

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺組織異質性的惡性腫瘤，是一種女性常見的疾病。據(jù)統(tǒng)計，近年來乳腺癌的發(fā)病率居高不下，死亡率逐漸增加，嚴重危害女性的健康[1]。雖然乳腺癌的治療技術有了巨大的提高，主要治療手段包括手術、化療、放療及內分泌治療等，其中化療是乳腺癌常用的治療手段，有研究表明，紫杉醇(paclitaxel)類化合物對乳腺癌有確切的療效，是目前國際公認的抗腫瘤藥物，但大多數(shù)患者易產生耐藥性[2-4]。因此研究增強紫杉醇化療敏感性的藥物是臨床治療的重點和難點。二甲雙胍(metformin)是一種傳統(tǒng)的胰島素增敏劑, 常用于治療2型糖尿病。近幾年研究表明，二甲雙胍參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并具有降低發(fā)病風險、改善預后的作用[5-7]。本研究通過采用二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇作用于人乳腺癌MCF-7細胞系，觀察其對細胞活力及凋亡的影響，探討二甲雙胍和紫杉醇聯(lián)合作用對乳腺癌細胞的協(xié)同作用，同時檢測一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路蛋白、Bax和Bcl-2等的表達，探討藥物與AMPK信號通路和Bcl-2家族的關系及相關機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人乳腺癌細胞系MCF-7(原位雌激素受體陽性乳腺癌細胞系)購自中科院上海細胞庫；二甲雙胍購自中國藥品生物制品檢定所；紫杉醇注射液購自上?？狄帢I(yè)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青公司；MTT和二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自Amresco；0.25%胰酶購自Sigma；細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和鼠抗人P21抗體購自北京中杉金橋有限公司；鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)抗體、兔抗人AMPKα抗體和鼠抗人caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 II 抗購自北京康為公司；鼠抗人Bcl-2抗體和鼠抗人Bax抗體購自武漢聯(lián)科有限公司。酶標儀購自Thermo；凝膠成像系統(tǒng)和熒光定量PCR儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞的培養(yǎng) 乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清并置于37 ℃、5% CO2、100%濕度下培養(yǎng)，待細胞貼壁生長并鋪滿瓶底，加入0.25%胰酶消化、傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2MTT法檢測不同濃度二甲雙胍作用下細胞的活力 收集對數(shù)期的MCF-7細胞，以合適密度接種于96孔板上，加入180 μL不同濃度(2、5、10、20、40和80 mmol/L)二甲雙胍培養(yǎng)細胞，每組設置5個平行孔，以不加藥物作為對照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄孔內溶液，每孔加入150 μL DMSO，搖床中振蕩5 min，酶標儀中檢測490 nm波長下各孔吸光度(A)值，實驗重復5次，取平均值。

2.3二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對細胞活力的影響 收集對數(shù)期細胞，隨機分為對照組、二甲雙胍組、紫杉醇組、聯(lián)合組及聯(lián)合+compound C組，對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)臨床常規(guī)劑量和參考文獻[8]，采用選取2.4 mg/L紫杉醇、2 mmol/L的二甲雙胍單獨或者聯(lián)合培養(yǎng)細胞，聯(lián)合+compound C組細胞中加入AMPK信號通路抑制劑compound C (50 μmol/L)，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，加入20 μL MTT和150 μL DMSO，測定細胞490 nm波長下各孔A值。

2.4二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對細胞凋亡的影響 根據(jù)凋亡試劑盒說明書的指示，將對照組、二甲雙胍組、紫杉醇組、聯(lián)合組及聯(lián)合+compound C組細胞濃度調整為1×109/L，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，4 ℃染色15 min，流式細胞術分析細胞的凋亡率。

2.5RT-qPCR檢測細胞凋亡相關分子的mRNA水平 采用RT-qPCR法觀察二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達的影響。收集各組細胞，密度調整為4×106個，加入1 mL TRIzol試劑，充分溶解細胞，提取細胞中總mRNA。吸取3 μL 細胞總RNA，加入逆轉錄酶，反轉錄為cDNA。利用Primer 5.0軟件設計目的基因的引物序列并由上海生工公司合成，見表1。擴增體系為25 μL：12.5 μL PCR Mix，引物上、下游各0.5 μL，2 μL cDNA，加入雙蒸水補足至25 μL。擴增條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，各退火溫度 30 s，72 ℃ 38 s，40個循環(huán)。實驗重復3次，以β-actin為內參照，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2.6二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對細胞凋亡蛋白以及AMPK信號通路蛋白表達量的影響 收集各組細胞，洗滌、離心后，加入含PMSF的細胞裂解液，冰上裂解30 min，吸取上清，BCA法檢測蛋白濃度后稀釋。洗凈、晾干玻璃板，灌入12%的分離膠至預定高

表1 RT-qPCR的引物序列

度，并加入雙蒸水液封，室溫下靜置1 h。配制5%濃縮膠，棄去雙蒸水，加入濃縮膠，插入梳子，室溫靜置30 min。將配置好的凝膠板置于電泳槽中，加入電泳液；將蛋白樣品與5×樣品緩沖液混合，煮沸5 min，每孔加入10 μL樣品，進行電泳；濃縮膠電壓調整至80 V，分離膠電壓為100 V，電泳至溴酚藍到達凝膠底部。采用300 mA電流轉膜60～90 min，將凝膠中的蛋白轉移至硝酸纖維膜中。加入5%脫脂奶粉封閉2 h；加入 I 抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應 II 抗稀釋液，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；曝光、顯影、顯色，凝膠成像系統(tǒng)測定其灰度值，分析目的蛋白與內參照β-actin的灰度值比值，實驗重復3次，取平均值。

3 統(tǒng)計學處理

SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理，結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度二甲雙胍對乳腺癌MCF-7細胞活力的影響

MTT結果顯示，在給予不同濃度(2、5、10、20、40和80 mmol/L)的二甲雙胍培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞48 h后，不同濃度二甲雙胍均能抑制MCF-7細胞生長，并且抑制作用隨著二甲雙胍濃度的增加逐漸增強；其中二甲雙胍在2 mmol/L時即可抑制細胞的活力，所以后續(xù)實驗以二甲雙胍2 mmol/L為處理因素，見圖1A。

2 二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌MCF-7細胞活力的影響

與對照組相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲雙胍單獨使用可顯著抑制細胞的生長(P<0.05)；聯(lián)合使用的抑制作用較單獨使用時增強(P<0.05)；與聯(lián)合組相比，加入AMPK信號通路抑制劑compound C可顯著削弱二甲雙胍和紫杉醇抑制細胞活力的作用(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1.The effect of metformin combined with paclitaxel on the viability of breast cancer MCF-7 cells. A: the effect of metformin at different concentrations on the viability of breast cancer MCF-7 cells; B: the effect of metformin combined with paclitaxel on the viability of breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

3 二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響

與對照組相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲雙胍單獨使用可顯著促進細胞的凋亡(P<0.05)；聯(lián)合使用促凋亡作用較單獨使用時增強(P<0.05)；加入compound C可顯著削弱二甲雙胍和紫杉醇促進細胞凋亡的作用，與聯(lián)合組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of metformin combined with paclitaxel on the apoptosis of breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

4 二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細胞凋亡相關分子mRNA和蛋白表達的影響

RT-qPCR和Western blot結果顯示，二甲雙胍和紫杉醇單獨或者聯(lián)合使用均可顯著調節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-3的表達量。與對照組相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲雙胍單獨使用可顯著上調Bax和caspase-3的mRNA和蛋白水平(P<0.05)，下調Bcl-2的mRNA和蛋白水平(P<0.05)；聯(lián)合使用較單獨使用時顯著促進Bax和caspase-3的mRNA和蛋白水平(P<0.01)，抑制Bcl-2的mRNA和蛋白水平(P<0.01)；加入compound C可顯著削弱二甲雙胍和紫杉醇促進細胞Bax和caspase-3 mRNA和蛋白水平及抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的作用，與聯(lián)合組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effects of metformin combined with paclitaxel on the mRNA and protein levels of Bcl-2, Bax and caspase-3 in the MCF-7 cells. A: the relative expression of mRNA; B: the relative protein levels. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △ P<0.05 vs combination group.

5 二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對AMPK信號通路的影響

與對照組相比，2.4 mg/L紫杉醇和2 mmol/L的二甲雙胍單獨使用可顯著促進AMPKα和P21蛋白表達(P<0.05)；聯(lián)合使用的促進作用較單獨使用時增強(P<0.05)；加入compound C較聯(lián)合組可顯著抑制AMPKα和P21蛋白表達(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of metformin combined with paclitaxel on the expression of AMPK signaling pathway-related proteins. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs metformin group or paclitaxel group; △P<0.05 vs combination group.

討 論

近年來，乳腺癌患者的預后不良以及復發(fā)等問題是臨床治療面臨的重要問題，其主要原因是化療耐藥性的出現(xiàn)以及化療敏感性差。因此，尋找增強化療敏感性藥物是臨床醫(yī)師研究的重點和難點。二甲雙胍是一種胰島素增敏劑，具有療效好、安全性高及副作用少等特點。臨床上常使用二甲雙胍調節(jié)糖代謝，改善糖尿病患者高血糖的狀態(tài)。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗腫瘤作用，可顯著抑制卵巢癌、肝癌、宮頸癌和喉癌等腫瘤細胞的生長、分化[9-12]。臨床上研究發(fā)現(xiàn)，患有糖尿病的病人口服二甲雙胍可降低腫瘤的發(fā)病率，且并發(fā)有卵巢癌和子宮癌時，患者的預后也較好[13]。因此，研究二甲雙胍對腫瘤的治療作用具有廣泛的臨床應用前景。紫杉醇是臨床上常用的腫瘤化療藥物，但易產生耐藥性，且副作用如消化道異常、骨髓抑制等經常出現(xiàn)，嚴重影響腫瘤患者的生活質量和預后。其中化療耐藥性是乳腺癌患者死亡的主要原因。本實驗結果顯示，二甲雙胍對乳腺癌MCF-7細胞增殖具有顯著抑制性，且具有一定的濃度依賴性，并可誘導細胞凋亡，與紫杉醇聯(lián)合作用具有協(xié)同抗乳腺癌細胞增殖的作用。因此二甲雙胍和紫杉醇聯(lián)合使用可能是一個有效治療乳腺癌的方法，為臨床二者聯(lián)合治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

AMPK信號通路是組織細胞中最重要的能量代謝調節(jié)通路之一，對于維持組織細胞內AMP/ATP的比例、調控蛋白與脂肪的合成與分解，以及細胞的應激均有重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK信號轉導通路還參與了對腫瘤細胞增殖與凋亡過程的調控[14-16]。研究表明，二甲雙胍可直接或間接激活細胞中AMPK[17-18]。二甲雙胍可阻礙細胞線粒體呼吸鏈復合體的電子傳遞過程，降低三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的合成，促使細胞內一磷酸腺苷(AMP)的水平增加，升高AMP/ATP的比例，從而間接活化AMPK?，F(xiàn)已證實，當AMPK信號通路被激活時，可引起細胞內P21途徑的活化，從而阻滯細胞周期進程[19]。在本實驗中，Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍、紫杉醇單獨或聯(lián)合使用作用于MCF-7細胞，AMPKα和P21的表達量均上調，且聯(lián)合用藥較單獨用藥AMPKα和P21表達上調更明顯，加入AMPK信號通路抑制劑compound C可緩解二甲雙胍和紫杉醇的協(xié)同促進作用，進一步表明二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇可能是通過激活AMPK，激活P21途徑，調控下游靶基因的表達，進而發(fā)揮抑制MCF-7細胞活力、誘導細胞凋亡的作用。

腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞的過度增殖和凋亡減少有關。細胞凋亡是一個多基因調控的復雜過程，受到抑制細胞凋亡基因和促進細胞凋亡的基因的共同調控。Bcl-2家族是調控細胞凋亡的重要蛋白，其中Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax促進細胞凋亡。在細胞內，二者可結合成異質二聚體而失活，而當二者的相對表達量失衡時，可破壞線粒體膜的完整性，最終激活caspase-3，引起細胞凋亡進程的改變[20-22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能抑制抗凋亡的 Bcl-2 的表達，促進促凋亡的 Bax 的表達，促進細胞發(fā)生凋亡[23]。本研究的結果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，二甲雙胍和紫杉醇可顯著抑制Bcl-2的表達，促進Bax和caspase-3的表達，表明二甲雙胍和紫杉醇能使MCF-7細胞中Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白水平上調，最終促進凋亡終末效應因子caspase-3的表達增加，誘導細胞凋亡，從而抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長。

綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇可通過激活AMPK信號轉導通路，調控P21途徑和細胞凋亡蛋白的水平，激活細胞凋亡信號通路，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。