賀新偉， 郭貴龍， 陳積賢， 吳偉力

(瑞安市人民醫(yī)院， 浙江 瑞安 325200)

黑色素瘤是最常見的皮膚腫瘤之一[1]。雖然中國是黑色素瘤的低發(fā)區(qū)，但其發(fā)病率卻呈逐年上升的趨勢[2]。黑色素瘤具有藥物抵抗和高轉(zhuǎn)移率的特性，因此患者預(yù)后往往較差[3-4]。雖然目前針對黑色素瘤的治療有一定進展，特別是在靶向治療和免疫治療方面，但轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的預(yù)后仍不容樂觀[5]。因此，尋找新的潛力治療藥物尤為重要。烏骨藤(RadixFissistigmaeglaucescentis)是我國傳統(tǒng)藥物，具有較強的抗炎活性，常被用于治療關(guān)節(jié)炎、氣管炎、膀胱炎、扁桃體炎及肺炎等疾病[6]?，F(xiàn)代研究表明，烏骨藤提取物(Marsdeniatenacissimaextract，MTE)還具有抗腫瘤活性，能抑制食道癌、胃癌、肺癌和肝癌等多種腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[7-10]。同時，MTE還能降低腫瘤對化療藥物的抵抗性[11-12]。但其對黑色素瘤的作用及作用機制還未見報道。本研究將以小鼠皮膚黑色素瘤細胞系B16-F10為研究對象，探究MTE對黑色素瘤細胞活力及凋亡的作用及作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑與儀器

MTE由西安潤澤生物技術(shù)有限公司提供(貨號為20101),用DMSO助溶，用細胞培養(yǎng)液配制濃度為5 mg/L的MTE溶液，臨用前稀釋，且DMSO終濃度不超過0.1%。

DMEM-H培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)購自Abcam；抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9抗體均購自Cell Signaling Technology(貨號分別為2586、9662和9508)；抗Ki67抗體購自Abcam(貨號為ab16667)；HRP標記山羊抗小鼠和HRP標記山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

HBS-1096A酶標儀購自南京德鐵實驗儀器公司；流式細胞儀購自Thermo Fisher；電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 黑色素瘤細胞系B16-F10購自ATCC，貨號為ATCC? CRL-6475TM。用含有10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

2.2MTT法檢測細胞存活率 將細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中,并隨機分為 0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L MTE組，每組加入相應(yīng)濃度的MTE處理24 h或分別處理0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，每孔加入20 μL MTT溶液于37 ℃孵育4 h后，加入150 μL DMSO，混勻后用酶標儀于570 nm處檢測細胞吸光度(A)值。

2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將細胞用不同濃度MTE處理72 h后，用PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶收集各組細胞，配制成1×109/L的細胞懸液，每個Falcon試管中加入100 μL細胞懸液，并加入5 μL Annexin V-FTTC和5 μL PI，避光孵育15 min后，加入結(jié)合緩沖液，1 h后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，以Q2區(qū)細胞比例為細胞凋亡率。

2.4Western blot檢測蛋白表達 用不同濃度MTE處理細胞或?qū)⒓毎譃锽16-F10組、MTE(200 mg/L)組、IGF-1(22 μg/L)組和MTE+IGF-1組，分別加入相應(yīng)濃度的MTE或(和)IGF-1處理后，加入RIPA裂解液提取細胞蛋白。用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調(diào)平。10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h后，加入適宜濃度 I 抗(Ki67, 1∶1 000; PCNA, 1∶800; cleaved caspase-3, 1∶1 000; cleaved caspase-9, 1∶1 000; Bax, 1∶1 200; Bcl-2, 1∶1 000)4 ℃封閉過夜。第2天棄去 I 抗，用TBST洗膜3次，加入相應(yīng) II 抗，室溫孵育 1 h后，TBST洗滌3次，滴加ECL顯色液曝光顯影。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析和秩和檢驗。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTE對黑色素瘤細胞活力的影響

與0 mg/L組比較，MTE作用24 h后，50 mg/L組、100 mg/L組和200 mg/L組細胞活力的變化差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1A；MTE作用72 h和96 h后，100 mg/L組和200 mg/L組的細胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖1B。同時，50 mg/L組、100 mg/L組和200 mg/L組細胞增殖蛋白Ki67的蛋白表達水平較0 mg/L組比較明顯降低(P<0.05)，100 mg/L組和200 mg/L組細胞的PCNA表達水平顯著低于0 mg/L組(P<0.05)，見圖3。這些結(jié)果表明高濃度MTE能抑制黑色素瘤細胞生長。

2 MTE對黑色素瘤細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與0 mg/L組比較，100 mg/L組和200 mg/L組黑色素瘤細胞的凋亡率明顯升高(P<0.01),見圖2；細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspas-3和cleaved caspase-9的蛋白水平也顯著增多(P<0.05或P<0.01)，見圖3。這些結(jié)果提示MTE能誘導(dǎo)B16-F10細胞凋亡。

3 MTE對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

為了研究MTE抑制B16-F10細胞活力、誘導(dǎo)細胞凋亡的機制，我們檢測了MTE處理細胞后，PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達情況。與0 mg/L組比較，50 mg/L組細胞的p-PI3K/PI3K和

Figure 1.The effect of MTE on the viability of melanoma cells. A: the effects of MTE at different doses on the viability of B16-F10 cells after treatment for 24 h; B: the effects of MTE at different doses on the viability of B16-F10 cells after treatment for 0, 24, 48, 72 and 96 h. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs 0 mg/L group.

Figure 2.The effect of MTE on the apoptosis of melanoma cells. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

p-AKT/AKT的比值明顯降低 (P<0.01)；100 mg/L組和200 mg/L組的mTOR蛋白明顯減少，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值明顯降低(P<0.01)，表明MTE能抑制黑色素瘤細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，見圖4。

4 激活PI3K/AKT/mTOR信號通路對MTE抑制細胞活力、誘導(dǎo)細胞凋亡作用的影響

為了進一步證明MTE抑制黑色素瘤細胞活力、誘導(dǎo)細胞凋亡作用與其抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)，我們采用IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR通路，并檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平的變化。實驗結(jié)果表明，IGF-1能顯著誘導(dǎo)p-PI3K蛋白水平的升高(P<0.05)，表明其可激活PI3K/AKT/mTOR信號通路；同時與B16-F10組比較，IGF-1

Figure 3.The effects of MTE on the protein levels of proliferation-related and apoptosis-related proteins in the melanoma cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 mg/L group.

能明顯促進黑色素瘤細胞Ki67、PCNA和Bcl-2的表達，抑制Bax的表達(P<0.05)，此外，IGF-1還能顯著減弱MTE (200 mg/L)抑制B16-F10細胞Ki67、PCNA和Bcl-2表達和促進Bax表達的作用 (P<0.05)，與MTE(200 mg/L)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

討 論

烏骨藤是我國傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)認為其具有祛風(fēng)濕、活血和止血的功效?，F(xiàn)代研究表明其具有抗腫瘤活性，并且其制劑消癌平已經(jīng)應(yīng)用于臨床晚期乳腺癌、胃癌、肺癌及大腸癌等的輔助治療[13-15]。研究表明，烏骨藤抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，并且其還可通過抑制血管新生減緩癌癥的發(fā)展[14-16]。同時，MTE還可抑制淋巴癌細胞增殖，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡從而抑制腫瘤生長[17-18]。在本研究中，我們用不同濃度MTE處理細胞發(fā)現(xiàn)，MTE處理細胞72 h和96 h時能顯著抑制黑色素瘤細胞B16-F10的活性，同時還能抑制細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA的表達，表明MTE具有抑制黑色素瘤細胞生長的作用。

Figure 4.The effects of MTE on the protein levels of PI3K/AKT/mTOR pathway-related proteins. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

細胞凋亡抑制是腫瘤發(fā)展的重要機制之一，有效促進腫瘤細胞凋亡可抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MTE可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯促進腫瘤細胞凋亡，從而減緩腫瘤發(fā)展。本研究實驗結(jié)果表明，MTE可顯著促進黑色素瘤細胞凋亡，并能誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平，提示MTE在抑制黑色素瘤細胞活力的同時還可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，從而減緩黑色素瘤的發(fā)展。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是調(diào)控細胞增殖和凋亡的經(jīng)典通路之一[20]。PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活可以通過調(diào)控生長因子的表達抑制多類細胞凋亡[21-22]。抑制PI3K活性可顯著抑制黑色素瘤細胞增殖[23]。研究表明，RAP抑制劑索拉菲尼可通過靶向調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡從而影響黑色素瘤的發(fā)展[24]。褪黑色素誘導(dǎo)黑色素瘤凋亡也與其抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)[25]。miR-425也可通過調(diào)控PI3K/AKT通路抑制黑色素瘤細胞增殖和遷移，同時誘導(dǎo)癌細胞凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，MTE能顯著抑制p-PI3K、p-AKT和mTOR的蛋白水平，表明MTE可抑制通路蛋白活化，從而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，提示MTE抑制黑色素瘤細胞發(fā)展、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用可能與其抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)。此外，用激活劑IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路后發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細胞Ki67和PCNA表達水平明顯升高，表明激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可顯著減弱MTE抑制黑色素瘤細胞生長的作用。同時，IGF-1還能明顯減弱MTE誘導(dǎo)細胞凋亡作用，進一步表明，MTE抑制黑色素瘤細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡與其調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。

Figure 5.The role of activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in the effects of MTE on the expression of proliferation- and apoptosis-related proteins. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs B16-F10 group; #P<0.05 vs MTE (200 mg/L) group.

綜上所述，MTE能夠抑制黑色素瘤細胞生長，并誘導(dǎo)黑色素瘤細胞凋亡，從而減緩黑色素瘤的發(fā)展，并且其機制與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。本研究對MTE對黑色素瘤的作用及作用機制進行了初步探討，為MTE用于黑色素瘤的治療提供實驗數(shù)據(jù)的支撐。