楊 洲， 剛海菊， 覃先蓬， 賈貴清， 王 波， 楊 春， 趙高平

(1四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科, 2成都職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)分院， 四川 成都 610000)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年的總體發(fā)病率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，且大部分患者在確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，能夠接受根治性手術(shù)的患者，亦有半數(shù)最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因此，大多數(shù)患者需進(jìn)行術(shù)后化療[1-2]。鉑類是結(jié)直腸癌化療常用的藥物，順鉑(cisplatin)在鉑類中有較廣泛的應(yīng)用，但具有一定的毒副作用，因此提高結(jié)直腸癌對(duì)順鉑的化療敏感性備受研究者關(guān)注。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是Krüppel樣因子家族中的一個(gè)成員，人KLF4基因定位于9q31，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化及維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)等多種重要的功能，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，如在結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤中具有抑癌樣作用，而在口腔鱗癌等腫瘤中表達(dá)升高，發(fā)揮促癌樣作用[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制骨肉瘤中KLF4的表達(dá)可增加順鉑對(duì)腫瘤的化療敏感性[6]；重組人KLF4可以提高肝癌細(xì)胞的順鉑化療耐受性[7]。目前已證實(shí)，KLF4是消化道上皮的重要抑癌基因[8-9]，但其對(duì)結(jié)直腸癌生物學(xué)特性及是否可增加順鉑化療敏感性還未清楚。本研究通過過表達(dá)KLF4，檢測(cè)其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力、凋亡及順鉑化療敏感性的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

胎牛血清購(gòu)自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen； CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基；Bradford試劑盒購(gòu)自上海生工；抗KLF4、p-IκBα、細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)抗體均購(gòu)自Santa Cruz。MK3酶標(biāo)儀(Thermo)；Bio-Plex200流式細(xì)胞儀(BioRad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸黏膜上皮NCM460細(xì)胞及結(jié)直腸癌Caco2、SW480和HCT116細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在37 ℃解凍后，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2pcDNA3.1-KLF4轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分為對(duì)照(control)組(僅加入脂質(zhì)體)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒)和pcDNA3.1-KLF4組(轉(zhuǎn)染構(gòu)建的pcDNA3.1-KLF4過表達(dá)質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d接種SW480細(xì)胞(每孔2.5×105)于6孔板，每孔加入1 mL，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)60%～75%時(shí)，更換培養(yǎng)液(不含血清及抗生素)，按照上述分組參照轉(zhuǎn)染說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 h，換為含血清和無(wú)抗生素培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Wes-tern blot檢測(cè)各組細(xì)胞中KLF4的表達(dá)。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 在生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的NCM460、Caco2、SW480、HCT116細(xì)胞及各處理組的SW480細(xì)胞中加入適量的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解反應(yīng)30 min，離心收集上清液，上清即為提取的總蛋白，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度?？偟鞍鬃冃蕴幚砗笕?0 μg上樣，SDS-PAGE分離蛋白后通過半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫條件下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h，洗膜，4 ℃搖床孵育皆按照1∶1 000稀釋的抗KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin抗體過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗，ECL發(fā)光劑顯影，掃描膠片后用圖像分析軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參照計(jì)算KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin的相對(duì)蛋白量。

2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的SW480細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h進(jìn)行同步化處理，將pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組，每組均設(shè)置5個(gè)平行孔，轉(zhuǎn)染方法同2.2，轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)基，pcDNA3.1-KLF4組加入1 mg/L順鉑，，實(shí)驗(yàn)分為pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1-KLF4+順鉑，順鉑處理48 h后，在各組的每孔細(xì)胞中加入CCK8試劑10 μL，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI雙染法。消化收集參照2.4分組處理的3組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，binding緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，室溫避光環(huán)境反應(yīng)10～15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測(cè) PBS洗滌參照2.4分組處理的3組細(xì)胞，懸浮細(xì)胞于含有終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱37 ℃避光條件孵育1 h，孵育完畢用不含血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2×108，取10 μL細(xì)胞懸液加到載玻片上，蓋片。將玻片固定在激光共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)DCF熒光分布及強(qiáng)度變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)直腸癌細(xì)胞中KLF4的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與人正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌Caco2、SW480和HCT116細(xì)胞中KLF4的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The protein expression of KLF4 in the colorectal can-cer cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NCM460 cells.

2 pcDNA3.1-KLF4轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的效果

pcDNA3.1組KLF4的蛋白表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， pcDNA3.1-KLF4組KLF4的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the expression of KLF4 in the SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF4增加順鉑對(duì)SW480細(xì)胞活力的抑制作用

以A值反映細(xì)胞活力，間接反映出細(xì)胞的增殖能力，CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-KLF4組的細(xì)胞活力顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的細(xì)胞活力顯著低于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased the inhibitory effect of cisplatin on the viability of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF4增加順鉑對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

pcDNA3.1-KLF4組的細(xì)胞凋亡率顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的細(xì)胞凋亡率顯著高于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased cisplatin-induced apoptosis of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

5 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF4增加順鉑促進(jìn)SW480細(xì)胞生成ROS的作用

細(xì)胞內(nèi)的ROS水平與檢測(cè)的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出正相關(guān)。pcDNA3.1-KLF4組的ROS含量顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的ROS含量顯著高于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05)，見圖5。

6 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF4對(duì)順鉑處理的SW480細(xì)胞p-IκBα、cyclin D1和survivin蛋白水平的影響

Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子IκBα的磷酸化水平及下游蛋白cyclin D1和survivin的表達(dá)，結(jié)果顯示, pcDNA3.1-KLF4組的p-IκBα蛋白水平顯著高于pcDNA3.1組，cyclin D1和survivin的蛋白水平顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05)；而pcDNA3.1-KLF4+順鉑組的p-IκBα蛋白水平顯著高于pcDNA3.1-KLF4組，cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)顯著低于pcDNA3.1-KLF4組(P<0.05)，見圖6。

討 論

多項(xiàng)研究顯示，一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、原癌基因和抑癌基因等與結(jié)直腸癌的化療敏感性密切相關(guān)，并取得了一定的成果[10-12]，但結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制還未清楚。KLF4在腫瘤中具有雙向功能，有癌基因或抑癌基因樣作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等有密切聯(lián)系[13]。有研究顯示，肺癌中敲減KLF4的表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而過表達(dá)KLF4可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]；過表達(dá)KLF4的白血病細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，凋亡增加[15]。目前也有多項(xiàng)研究證實(shí)KLF4參與胃腸道腫瘤形成，有研究顯示，胃癌中KLF4表達(dá)水平降低，其表達(dá)與胃癌的分化程度及進(jìn)展呈現(xiàn)出正相關(guān)，可促進(jìn)胃癌增殖[16-17]；結(jié)腸癌中過表達(dá)KLF4可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將過表達(dá)KLF4基因種植到裸鼠體內(nèi)，也可明顯降低腫瘤大小[18-19]。因此，KLF4表達(dá)可作為胃癌和結(jié)腸癌預(yù)后判斷的一項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)。結(jié)直腸癌中KLF4是否可增強(qiáng)化療敏感性還未明確。

Figure 5.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the content of ROS in the SW480 cells treated with cisplatin (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中KLF4的表達(dá)均明顯降低，這與前人的研究結(jié)果是一致的，提示KLF4對(duì)結(jié)直腸癌的負(fù)向調(diào)控作用。將過表達(dá)KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4后結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力受到抑制，凋亡增加，且可增加順鉑對(duì)結(jié)直腸癌活力的抑制和凋亡的促進(jìn)作用。這提示過表達(dá)KLF4可增加順鉑對(duì)結(jié)直腸癌的順鉑化療敏感性。

ROS可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體途徑引起細(xì)胞的凋亡，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要促進(jìn)因子。低水平ROS可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理功能，而細(xì)胞內(nèi)大量的ROS的積聚可引起細(xì)胞的凋亡[20-21]。有研究顯示，結(jié)直腸癌中ROS水平參與了癌細(xì)胞的凋亡[22]。NF-κB可參與腫瘤、免疫等過程，大多數(shù)情況下NF-κB是無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)受到刺激后，可引起IκBɑ發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκBɑ與NF-κB分離，NF-κB游離出來(lái)而釋放入核而后行使轉(zhuǎn)錄因子功能，誘導(dǎo)一些靶基因的表達(dá)，如cyclin D1、survivin、Bcl-2等[23-24]。有研究顯示，異?；罨腘F-κB與一些腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[25-26]。結(jié)直腸癌中NF-κB的含量增多，其表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，異?；罨腘F-κB信號(hào)可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB信號(hào)可降低結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[27-28]。過表達(dá)KLF4是否可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展還未清楚。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF4后ROS含量明顯升高， IκBɑ的磷酸化水平升高，并可抑制靶基因cyclinD1和survivin的表達(dá)，提示KLF4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力和凋亡的影響可能與提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量及抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞KLF4基因表達(dá)可降低癌細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增加順鉑化療敏感性，其機(jī)制可能與提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量及下調(diào)NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。該研究可能為結(jié)直腸癌治療提供了新的途徑，但還需更多研究理論及臨床試驗(yàn)證實(shí)。

Figure 6.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules in the SW480 cells treated with cisplatin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.