林 輝， 倪婷娟， 張 杰， 池菊芳， 項美香， 郭航遠, △

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江 溫州 325000； 2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 浙江 杭州 310000； 3浙江大學(xué)紹興醫(yī)院， 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科， 浙江 紹興 312000)

蒽環(huán)類藥物，如阿霉素(即多柔比星，doxorubicin，DOX)是各種血液、軟組織腫瘤和實體瘤治療的基石類藥物，具有超過50 年的臨床使用歷史。心臟毒性與阿霉素治療呈劑量依賴性關(guān)系，這也成為臨床限制其應(yīng)用的主要原因[1]。阿霉素誘導(dǎo)心肌毒性的機制復(fù)雜，可能涉及氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、凋亡和自噬等多條途徑[2]。但是，目前尚無一種可以有效減輕阿霉素所致心臟毒性的理想藥物。多酚類(polyphenols)物質(zhì)是一類具有抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基和保護心血管作用的天然化學(xué)物。本團隊先前一直致力于黃酒及其主要成分黃酒多酚化合物(yellow wine polyphenol compounds，YWPC)對心血管系統(tǒng)的保護作用的研究，發(fā)現(xiàn)黃酒多酚具有保護內(nèi)皮細胞損傷，抑制平滑肌細胞增殖和表型轉(zhuǎn)化，減輕動脈粥樣硬化形成的作用[3-6]。但是黃酒多酚是否能減輕阿霉素所致心臟毒性仍未知。因此，本研究擬通過動物實驗?zāi)M阿霉素所致心臟毒性，觀察黃酒多酚對阿霉素所致心臟毒性的作用，并從氧化應(yīng)激和細胞凋亡角度探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

40只健康無特定病原體(specific-pathogen-free, SPF)級 Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號為SYXK(浙) 2016-0022，8周齡左右，體重(250±20) g。阿霉素(Cat. HY-15142A)購自MedChemExpress；黃酒多酚由上海中藥制藥技術(shù)有限公司分離提取，純度>60%；蘇木素-伊紅(HE)染色液(Cat. DH0006-2)和Mallory磷鎢酸蘇木素染色(PTAH自然氧化法)試劑盒(Cat. DC0002-3)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Cat. 11684817910)購自瑞士羅氏公司；抗Bax抗體(Cat. ab32503)和抗Bcl-2抗體(Cat. ab32124)購自Abcam；抗cleaved caspase-3抗體(#9664)、抗β-actin抗體(#4970)和HRP標記兔 II 抗(#7074)購自CST；心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Cat. ml003202)購于上海酶聯(lián)公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒(Cat. BC0680)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)活性檢測試劑盒(Cat. BC1140)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性檢測試劑盒(Cat. BC1560)購自北京索萊寶科技有限公司；DAPI(Cat. D9542)購自Sigma；超氧化物陰離子熒光探針二氫乙啶(dihydroethidium，DHE； Cat. S0063)、過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒(Cat. S0051)、 總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(Cat. S0101)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(Cat. S0131)、 谷胱甘肽(glutathione， GSH)檢測試劑盒(Cat. S0053)以及Western blot相關(guān)試劑均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1實驗分組 實驗共分4組：DOX組大鼠腹腔注射2 mg/kg的DOX(濃度0.2 g/L，避光保存)，定于每周一、三、五上午9時給藥，連續(xù)給藥4周，累計劑量24 mg/kg;對照(control)組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水; YWPC組大鼠定于每日中午12點通過灌胃給予30 mg/kg劑量(總體積2 mL)，每次灌胃后觀察30 min; DOX+YWPC組大鼠在腹腔注射阿霉素的同時，給予YWPC灌胃處理。所有實驗大鼠在4周后結(jié)束實驗。

2.2大鼠心功能測定 4周后，通過小動物麻醉機(R510IP，購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司)使用異氟烷麻醉大鼠，胸前備皮，在飛利浦IE33系統(tǒng)下，使用s5-1探頭(12～14 MHz)檢測大鼠心功能。應(yīng)用系統(tǒng)自帶的飛利浦QLab 9軟件測量所有大鼠的左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)、 收縮期左室內(nèi)徑(left ventricular internal dimension at systole，LVIDs)和舒張期左室內(nèi)徑(left ventricular internal dimension at diastole，LVIDd)。

2.3外周血心肌酶譜檢測 測量心功能結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)1 d，脊髓脫臼法處死大鼠，迅速打開腹腔，下腔靜脈取血，儲存于促凝管中，靜置30 min后，3 500 r/min離心5 min，取上清即血清置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。按試劑盒方法，檢測血清LDH、CK、AST和cTnI的水平。

2.4心臟組織氧化和抗氧化成分檢測 下腔靜脈取血后，開胸取出心臟，從左心室處予預(yù)冷生理鹽水沖洗心臟，在室間隔處切開心臟，將左半部分心臟組織置于液氮中保存待用，剩余部分用10%中性福爾馬林固定。隨后，取液氮中各組大鼠心臟組織于冷PBS(pH 8.6)中勻漿，制備10%勻漿液，按試劑盒方法進行操作，檢測心肌組織中CAT、SOD、MDA和GSH水平。

2.5心臟組織學(xué)觀察 取福爾馬林固定的各組心臟組織，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋和切片。切片進行HE染色：常規(guī)烤片、脫蠟后，伊紅染色45 s，PBS沖洗，隨后蘇木素染色30 s，PBS沖洗后溫水返藍，干燥后二甲苯封片。使用萊卡DM3000生物顯微鏡拍照。切片PTAH染色：切片脫蠟至水后入草酸溶液漂白2 min，隨后浸入Mallory PTAH染色液浸染48 h，取出切片，直接用95%乙醇迅速洗去多余染液，封片后拍照觀察。

2.6心臟組織DHE染色 取液氮中凍存的心臟組織進行冰凍切片，配置10 μmol/L的DHE探針濃度，每個樣本滴加100 μL，避光37 ℃孵育50 min；PBS洗3遍，隨后滴加100 μL的濃度為2 mg/L的DAPI孵育5 min，PBS清洗后使用甘油封片，熒光顯微鏡下觀察和攝片。使用ImageJ軟件進行熒光強度分析，并與對照組的熒光強度進行比較。

2.7心臟組織心肌細胞凋亡的檢測 使用TUNEL法檢測心臟組織切片中心肌細胞凋亡。常規(guī)脫蠟至水后，按照試劑盒說明對上述各組心肌組織切片進行染色。用Proteinase K工作液處理組織15 min，PBS漂洗2次后滴加TUNEL反應(yīng)液(50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP)反應(yīng)60 min。漂洗后加50 μL converter-POD繼續(xù)反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡拍照。

2.8Western blot檢測凋亡相關(guān)因子的蛋白表達 取心臟組織約0.1 g，加入RIPA裂解液和PMSF混合液300 μL，在4 ℃條件下進行勻漿提取蛋白，BCA試劑定量，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離。隨后，使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別使用抗Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和β-actin抗體4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后滴加 II 抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液暗室進行顯影。使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行膠片拍攝并使用Quantity One軟件對蛋白灰度值進行定量分析。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件和GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有定量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠心臟功能的影響

與對照組和YWPC組相比，DOX組大鼠左心室功能相關(guān)指標LVEF和LVES明顯減少，而LVIDs和LVIDd明顯增加(P<0.05)；DOX+YWPC組大鼠以上指標明顯得到改善(P<0.05)，見表1。

表1 黃酒多酚對阿霉素處理大鼠心功能的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

2 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠外周血心肌酶譜的影響

DOX處理可明顯增加心臟細胞損傷相關(guān)血清指標，與對照組相比，DOX組的LDH、CK、AST和cTnI水平均明顯增加(P<0.05)；而使用30 mg·kg-1·d-1的YWPC干預(yù)后，與DOX組相比，血清的LDH、CK、AST和cTnI水平均下降(P<0.05)；但是，與對照組相比，單獨使用YWPC并不影響以上這些指標的水平，見表2。

表2 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠血清LDH、CK、AST和cTnI的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

3 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠心臟組織形態(tài)的影響

隨后，我們對大鼠組織學(xué)進行評估，HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組和YWPC組大鼠心肌纖維束排列整齊，無明顯組織病理學(xué)改變；而阿霉素組大鼠的心肌纖維排列明顯紊亂，出現(xiàn)大量損傷的心肌細胞，細胞核溶解；使用黃酒多酚干預(yù)后，上述阿霉素所致的心肌損傷得到明顯改善，見圖1。PTAH染色進一步發(fā)現(xiàn)，與對照組和黃酒多酚組相比，阿霉素組大鼠出現(xiàn)明顯的肌纖維解體；而阿霉素+黃酒多酚組肌纖維解體的表現(xiàn)明顯減輕，見圖2。

Figure 1.HE staining showed the representative photomicrographs of the heart tissue sections from the rats treated with DOX and YWPC. The yellow arrows indicated the injured myocardial cells, including karyolysis and derangement of the muscle fibers. The scale bar=100 μm.

Figure 2.PTAH staining demonstrated the effects of DOX and YWPC on the muscle fibers in heart tissues from the rats in different groups. Blue indicated muscle fibers (the parts that not displayed blue suggested the disorganization of the muscle fibers), and red brown indicated collagen fibers. The scale bar=100 μm.

4 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠氧化應(yīng)激和抗氧化相關(guān)成分的影響

鑒于YWPC能減輕阿霉素的心臟毒性，我們進一步探討其可能作用機制。DHE染色結(jié)果表明，DOX處理明顯增加心肌組織活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平，而YWPC處理可明顯降低ROS的水平(P<0.05)，見圖3。同時，我們檢測心臟組織中氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，DOX處理減少SOD、CAT和GSH等抗氧化酶的活性和水平，增加脂質(zhì)過氧化指標MDA的水平(P<0.05)；而YWPC處理可明顯逆轉(zhuǎn)上述改變。單獨使用YWPC對心肌組織內(nèi)SOD、CAT、MDA和GSH水平無影響，見表3。

5 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果表明，DOX處理明顯增加心肌細胞凋亡數(shù)目(P<0.05)，而加用YWPC干預(yù)后心肌細胞凋亡數(shù)目明顯減少(P<0.05)，見圖4A。同時，Western blot實驗表明，DOX處理明顯增加凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3蛋白的水平；而YWPC干預(yù)后上述指標明顯下降(P<0.05)，見圖4B。

Figure 3.DHE staining showed the effects of YWPC on the levels of oxidative stress in heart tissues of DOX-treated rats. Staining cells with red indicated DHE-positive cells; DAPI staining (blue) indicated nucleus. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs DOX group.

表3 黃酒多酚對阿霉素處理的大鼠氧化應(yīng)激和抗氧化相關(guān)分子水平的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

討 論

阿霉素因抗瘤譜廣，臨床療效高，目前仍是臨床上治療多種癌癥的一線藥物，但阿霉素所致的心臟毒性越來越受到關(guān)注。阿霉素與心肌有較高的親和力，大劑量阿霉素可導(dǎo)致嚴重急性擴張性心肌病和心肌損傷導(dǎo)致心臟功能衰竭，威脅到患者生命[7]。因此，如何有效防治阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性是許多研究的探索方向。

本研究采用多次注射阿霉素來構(gòu)建慢性心臟毒性模型，心臟超聲檢查發(fā)現(xiàn)大鼠心臟收縮功能明顯下降。血清心肌酶，如CK、LDH以及cTnI等，可作為評估心肌損傷嚴重程度的生物標志物。阿霉素處理明顯增加上述指標水平，提示心肌嚴重損傷。我們進一步發(fā)現(xiàn)阿霉素處理引起心肌纖維排列紊亂和肌纖維解體，出現(xiàn)大量損傷的心肌細胞，這與先前的報道一致[8]。

近年來，鑒于多酚類物質(zhì)的抗氧化活性，學(xué)者們開始研究使用多酚類物質(zhì)來抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)。例如，姜黃素對阿霉素所致心臟毒性具有保護作用，其機制可能是通過抗炎、抗氧化和抗心肌細胞凋亡[9]；此外，報道發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可顯著減輕阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡，從而保護阿霉素所致的心肌損傷[10]；類似的，近期研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物通過調(diào)節(jié)NF-κB和P53通路發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[11]。由此可見，鑒于多酚類化合物的強抗氧化活性，其用于治療阿霉素所致的心臟毒性具有可行性。黃酒多酚是從紹興黃酒中提取的多酚類混合物。本團隊對黃酒多酚在心血管系統(tǒng)中的保護作用有豐富的研究經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)黃酒多酚可改善動脈粥樣硬化小鼠血脂水平[6]，抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞的增殖和遷移[12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，使用黃酒多酚干預(yù)后，阿霉素處理大鼠的心功能得到明顯改善，心肌損傷標志物明顯下降，心臟損傷顯著減輕。在發(fā)現(xiàn)黃酒多酚對阿霉素所致的心臟毒性具有保護作用的基礎(chǔ)上，我們進一步探討其可能機制。

Figure 4.The effects of YWPC on DOX-induced myocardial apoptosis. A: TUNEL staining showed the apoptotic cells in the heart tissues from different groups. Brown nuclei indicated TUNEL positive cells. B: Western blott analysis showed the levels of apoptosis-related proteins, including Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs DOX group.

目前，阿霉素所致的心臟毒性的機制仍不明確。但普遍認為氧化應(yīng)激是阿霉素心臟毒性的中間環(huán)節(jié)[13]。低濃度的氧化應(yīng)激是細胞代謝所需，而過量持續(xù)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等損傷[14]。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心臟損傷的第一道細胞防御包括幾種內(nèi)源性抗氧化酶，如SOD和CAT。若這些抗氧化酶不足以清除過量生成的自由基，則可導(dǎo)致心肌細胞脂質(zhì)過氧化和線粒體功能紊亂[15]。與先前的研究結(jié)果一致[16]，我們發(fā)現(xiàn)阿霉素可增加ROS的水平和MDA的水平，降低SOD和CAT活性，而黃酒多酚干預(yù)可逆轉(zhuǎn)上述改變，提示黃酒多酚可減少阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，有效抑制阿霉素誘導(dǎo)的心臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

通常認為，阿霉素誘發(fā)的氧化應(yīng)激激活凋亡信號導(dǎo)致心肌細胞凋亡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞色素C釋放，并且線粒體中caspase-3的激活導(dǎo)致心肌細胞凋亡[17]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用[18]。因此，我們檢測阿霉素處理后上述指標的改變，發(fā)現(xiàn)阿霉素明顯增加Bax/Bcl-2比例和cleaved caspase-3的水平，結(jié)合TUNEL實驗的結(jié)果，證實了阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。而黃酒多酚處理可有效抑制阿霉素引起的細胞凋亡，提示其可通過抑制凋亡來保護阿霉素所致的心臟損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃酒多酚可有效拮抗阿霉素所致的心臟毒性，其機制可能是通過減輕心臟氧化應(yīng)激水平和抑制心肌細胞凋亡。但本研究中的黃酒多酚是由不同單體成分組成，具體何種酚類成分發(fā)揮心臟保護作用尚不清楚，有待今后進一步研究。