陳少華, 黃靜穎， 譚家雄， 陳友純， 鐘 雋， 盧育洪， 郁 志， 李揚(yáng)秋,

(暨南大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所， 2附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510632)

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(progammed cell death protein 1，PD-1; 又稱CD279)是CD28家族成員的一種免疫球蛋白家族I型跨膜蛋白，參與了程序性細(xì)胞死亡過程[1-2]。正常情況下，PD-1與其配體PD-L1(又稱CD274)結(jié)合從而抑制活化T細(xì)胞的功能，維持外周T細(xì)胞對(duì)自身抗原的免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。PD-1主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在多種實(shí)體瘤T細(xì)胞中過表達(dá)，同時(shí)與高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的配體結(jié)合，能抑制T細(xì)胞的功能從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸機(jī)制。而在血液腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了PD-1高表達(dá)，多數(shù)研究認(rèn)為其主要表達(dá)于CD8+T細(xì)胞上，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的耗竭和失能[3-5]。由于不同的T細(xì)胞譜系行使功能有所不同，為了更好地確定PD-1在T細(xì)胞譜系中的分布，我們采用流式細(xì)胞技術(shù)，建立PD-1在CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)Vβ 24個(gè)亞家族中的分布特點(diǎn)的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步了解白血病和腫瘤病人等免疫抑制狀態(tài)提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 樣本資料

本研究收集了10例健康成人志愿者外周血，男性6例，女性4例，中位年齡26歲，樣本來自本研究所健康獻(xiàn)血者，樣本的采取已告知志愿者，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(periphral blood mononu-clear cells, PBMC)提取

EDTA抗凝管采集受試者外周靜脈血4～8 mL，利用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll配制)密度梯度離心分離PBMC，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞備用。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

3.1單細(xì)胞懸液的制備 準(zhǔn)備9只干燥流式管，分別標(biāo)注為同型管-ISO及A～H。將1×106個(gè)PBMC加入每只管中，制成單細(xì)胞懸液。

3.2抗體混懸液的配制

3.2.1同型抗體混懸液 1.5 mL 離心管中加入20 μL細(xì)胞染色緩沖液后，根據(jù)抗體說明書分別加入推薦劑量的CD45、CD3、CD4、CD8抗體和PE-Cy7-isotype control，充分混勻備用。

3.2.2全染抗體混懸液 1.5 mL 離心管中加入20 μL 細(xì)胞染色緩沖液后，根據(jù)抗體說明書分別加入推薦劑量的CD45-APC、CD3-Alexa Fluor?700、CD4-eFluor? 450、CD8-Percp-Cy5.5和PD-1-PE-Cy7，充分混勻備用。

3.3流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)前準(zhǔn)備 分別將同型抗體混懸液和全染抗體混懸液分別加入同型管-ISO和A～H流式管，充分混勻；按照IOTest? Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit (Beckmann Coulter; 該試劑盒一共8管,共包含24個(gè)TCR Vβ亞家族，每一管均為FITC和PE偶聯(lián)的復(fù)合抗體,標(biāo)為A～H，每一管復(fù)合抗體包含3個(gè)TCR Vβ亞家族的抗體)說明書，同型流式管不加任何TCR Vβ偶聯(lián)的流式抗體，A～H管依次加入推薦劑量的流式抗體，充分混勻，室溫避光孵育15～20 min。加入2～3 mL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞，300×g轉(zhuǎn)速下離心5 min后去除上清液。加入300～500 μL 細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，待上機(jī)。

3.4流式細(xì)胞術(shù)分析 采用BD FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行上樣檢測(cè)，先使用未經(jīng)染色的血細(xì)胞懸液調(diào)整儀器電壓后，分別使用FITC、APC-H7、Percp-Cy5.5、BV510、PE-Cy7、Alexa Fluor?647、PE和Pacific Blue單陽管，調(diào)整各熒光之間的熒光補(bǔ)償。至少收集100 000個(gè)CD3+細(xì)胞進(jìn)行分析，收集后的原始數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件(Becton，Dickinson and Company)進(jìn)行分析。TCR Vβ亞家族流式檢測(cè)結(jié)果參考IOTest? Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit所提供的正常人TCR Vβ亞家族分布頻率數(shù)據(jù)(Quick Reference Card數(shù)據(jù))。

結(jié) 果

在健康成人的檢測(cè)中，CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群中檢測(cè)的24個(gè)TCR Vβ亞家族總和，符合試劑盒所提供的Quick Reference Card數(shù)據(jù)。10例健康成人在CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞中的分布情況見圖1，健康成人在CD3+T細(xì)胞中主要優(yōu)勢(shì)利用Vβ2、Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ5.1、Vβ13.1和Vβ13.2；而在CD3+CD4+T細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)利用主要集中在Vβ2、Vβ3、 Vβ8、Vβ9、Vβ5.1和Vβ13.1等亞家族；在CD3+CD8+T細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)利用則在Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ9、Vβ13.1和Vβ13.2等亞家族中。

Figure 1.The distribution pattern of 24 TCR Vβ repertoires in T-cell subsets of peripheral blood from healthy individuals.

由于24個(gè)Vβ亞家族抗體共有8管，每一管均為FITC和PE偶聯(lián)的復(fù)合抗體(A～H)，每一管復(fù)合抗體包含3個(gè)TCR Vβ亞家族的抗體，如圖2所示，通過優(yōu)化后均可獲得界限清晰的細(xì)胞群，因此，進(jìn)一步分析顯示，PD1+細(xì)胞在健康成人CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的24個(gè)TCR Vβ亞家族中均可以檢測(cè)到，PD-1+細(xì)胞在T細(xì)胞各亞群中分布頻率雖有個(gè)體差異，但相對(duì)比較均衡，在CD4+T細(xì)胞中，PD-1+細(xì)胞在Vβ5.2+T細(xì)胞中的分布頻率較高，而在CD8+T細(xì)胞中，PD-1+細(xì)胞在Vβ11+和Vβ13.6+T細(xì)胞中的分布頻率較高，見圖3。

討 論

近年來免疫抑制性受體PD-1的研究越來越受到重視，主要是其在腫瘤靶向治療中開辟了新方向，為腫瘤靶向免疫治療帶來了新希望[6-7]。目前PD-1 的研究主要集中在實(shí)體瘤，而在血液惡性腫瘤中，免疫抑制性受體在T細(xì)胞免疫方面的研究較少。PD-1在T細(xì)胞亞群中的過表達(dá)嚴(yán)重影響病人的T細(xì)胞免疫狀態(tài)，導(dǎo)致T細(xì)胞無法行使正常的功能，PD-1可表達(dá)于抗腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞上，與腫瘤細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合形成的負(fù)性共刺激效應(yīng)，在體內(nèi)發(fā)揮限制、終止或減弱T細(xì)胞的應(yīng)答作用[3-5]，是形成T細(xì)胞免疫耐受的重要原因。由于這些負(fù)性共刺激分子參與腫瘤免疫應(yīng)答，使得免疫調(diào)控和免疫治療策略更為復(fù)雜。目前多數(shù)研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1在T細(xì)胞亞群CD4+和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況，而尚未涉及其在CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群下TCR Vβ各亞家族中的分布，而不同的TCR亞家族T細(xì)胞其識(shí)別不同的抗原表位，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)某些TCR亞家族T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增如Vβ21+T細(xì)胞與抗白血病作用密切相關(guān)[8-9]。因此本研究結(jié)合多年在TCR基因譜系研究的基礎(chǔ)上擬建立免疫抑制性受體PD-1在TCR Vβ各亞家族中的檢測(cè)方法，希望將其應(yīng)用于了解白血病病人外周血T細(xì)胞譜系中PD-1表型細(xì)胞分布頻率特點(diǎn)的研究。

Figure 2.Gating strategy for PD-1+ TCR Vβ1～3+ CD4+ /CD8+ T cells from one case of healthy individual by flow cytometry.

Figure 3.The distribution frequency of PD-1+ cells in CD3+, CD4+ and CD8+ TCR Vβ repertoire T cells in peripheral blood from healthy individuals.

我們首先利用健康成人外周血進(jìn)行檢測(cè)，確定TCR Vβ亞家族在T細(xì)胞各亞群中的檢測(cè)是否正確，檢測(cè)結(jié)果顯示完全符合試劑盒所提供的Quick Reference Card數(shù)據(jù)，所有樣本均可以檢測(cè)到24個(gè)Vβ亞家族，這與既往我們通過RT-PCR和基因掃描所發(fā)現(xiàn)的Vβ亞家族的分布特點(diǎn)相似，而且健康成人在CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞中主要優(yōu)勢(shì)利用的Vβ亞家族如Vβ2和Vβ5.1等均為高頻表達(dá)的亞家族[10]，而通過流式檢測(cè)我們還發(fā)現(xiàn)了其它高頻表達(dá)的亞家族，如Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ13.1和Vβ13.2亞家族。故此，我們從細(xì)胞表型的層面上建立了Vβ亞家族的分析方法，目的在于進(jìn)一步檢測(cè)這些細(xì)胞亞群表面所表達(dá)的其他受體的情況。我們近期研究顯示急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)病人外周血T細(xì)胞中PD-1+T細(xì)胞比例明顯升高[5]，為此，我們通過該研究方法，同時(shí)檢測(cè)PD-1在TCR Vβ各亞家族中的分布頻率，檢測(cè)結(jié)果表明所有亞家族均可以檢測(cè)到PD-1+T細(xì)胞，提示該方法的敏感性達(dá)到基本要求。同時(shí)，我們也初步發(fā)現(xiàn)了不同Vβ亞家族中PD-1+T細(xì)胞的比例有所差異，如PD-1+細(xì)胞在CD3+Vβ11+和Vβ14+T 細(xì)胞中的分布頻率較高，而在CD4+和CD8+T細(xì)胞中，則分別在Vβ5.2+和Vβ11+、Vβ13.6+T細(xì)胞中分布頻率較高，但總體的分布還是比較均衡。這可能是PD-1在健康成人中的一種特征性表現(xiàn)，但由于樣本量較少，還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入探討。同時(shí)，我們也初步利用所建立的檢測(cè)方法應(yīng)用于AML病人外周血T細(xì)胞的檢測(cè)，結(jié)果顯示AML病人CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞24個(gè)TCR Vβ亞家族的優(yōu)勢(shì)利用和健康成人的有所不同(結(jié)果未報(bào)道)。

在方法建立過程中，我們同時(shí)對(duì)比了利用全血或PBMC檢測(cè)各Vβ亞家族的分布和PD-1+T細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果相似，由于TCRVβ亞家族有24個(gè)之多，檢測(cè)需要的細(xì)胞數(shù)量較大，同時(shí)考慮到血液腫瘤病人外周血收集比較困難，病人淋巴細(xì)胞數(shù)差異較大等原因，我們最后采用了PBMC進(jìn)行檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)就是細(xì)胞數(shù)明確，可以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，同時(shí)也避免由于全血中的某些成分如血漿或血小板等影響抗體的偶聯(lián)。

總之，本項(xiàng)工作成功建立了多色熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞TCR Vβ亞家族中免疫抑制性受體PD-1分子免疫表型方法，初步探討其在健康人T細(xì)胞亞群TCR Vβ亞家族中的表型分布頻率特點(diǎn)，由于本研究仍在繼續(xù)中，尚有待擴(kuò)大樣本量，同時(shí)將該方法運(yùn)用于血液腫瘤病人的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究病人T細(xì)胞免疫抑制特點(diǎn)提供更全面的認(rèn)識(shí)。