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        ZP-20f對口腔鱗癌的抑制作用及機制研究

        2018-12-27 02:07:46孫學(xué)麗曹鐘義
        中國癌癥雜志 2018年11期

        孫學(xué)麗,曹鐘義

        南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科,江西 南昌 330000

        以口腔上皮鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)為主的口腔癌是常見的腫瘤之一,2015年中國新增病例約48 100例,死亡約22 100例[1]。雖然近年來手術(shù)、化療和放療等治療手段發(fā)展迅速,但效果不甚滿意,患者5年生存率約60%[2]。化療抵抗、不良反應(yīng)及腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移使得現(xiàn)有化療藥物遠不能滿足臨床需求。因此,針對OSCC,開發(fā)效果顯著、不良反應(yīng)輕微的新型治療藥物,是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重點。

        微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成的異二聚體,是細胞骨架的重要組成部分[3]。微管蛋白與微管之間聚集-解聚的動態(tài)平衡對維持細胞形態(tài)、細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運輸?shù)确矫娑季哂惺种匾淖饔茫?-5],已成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的重要靶點之一,如臨床上常用的抗腫瘤藥物紫杉醇能抑制微管解聚成微管蛋白,長春新堿則能抑制微管蛋白聚集形成微管。

        化合物ZP-20f(圖1)是一種結(jié)構(gòu)新穎的新型二芳基-β-內(nèi)酰胺類化合物,可以抑制微管蛋白聚集形成微管,從而抑制細胞有絲分裂,體外、體內(nèi)研究表明,其對卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細胞的生長具有較好的抑制作用[6]。為了研究ZP-20f對OSCC的抗腫瘤作用,拓展其抗腫瘤譜,本文在體外研究了該化合物對OSCC細胞系CAL-27、SCC-9增殖的抑制作用及機制。

        1 材料和方法

        1.1 主要試劑

        人舌鱗狀細胞癌細胞株CAL-27、SCC-9購自上海富衡生物科技有限公司,ZP-20f由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院王洋教授惠贈,DMEM培養(yǎng)基、雙抗和胰蛋白酶購自美國GE公司,胎牛血清購自美國GENIMI公司,細胞凋亡及周期檢測試劑盒購自美國BD公司。

        1.2 細胞培養(yǎng)

        人舌癌細胞株CAL-27和SCC-9于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的條件下,在含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),細胞生長至約85%匯合時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

        1.3 四甲基偶氮唑鹽實驗

        取對數(shù)期生長細胞,按4×103個/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的受試樣品繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL 5 mg/L的四甲基偶氮唑鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)基,再加入150 μL/孔DMSO,振蕩溶解15 min,酶標儀檢測波長570 nm時各孔吸光度(D)。每次試驗設(shè)置3個復(fù)孔,獨立重復(fù)3次,計算受試樣品的IC50。

        1.4 細胞周期檢測

        取對數(shù)生長的細胞,按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的受試樣品,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,胰蛋白酶消化,收集各皿中貼壁細胞,75%乙醇固定后,加入RNase和碘化丙啶(propidium iodide,PI)充分混勻后,室溫避光溫育20 min,采用流式細胞術(shù)檢測。

        1.5 細胞凋亡檢測

        取對數(shù)生長的細胞,按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的受試樣品,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,胰蛋白酶消化,收集細胞,采用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗滌后,用結(jié)合液重懸,分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染色,室溫避光溫育20 min,上機檢測。

        1.6 平板克隆實驗

        取對數(shù)生長期細胞,胰蛋白酶消化后,充分吹打成單個細胞,以1 500個/皿接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度的受試樣品培養(yǎng)48 h后,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,棄去培養(yǎng)基用無水甲醇固定,結(jié)晶紫染色后計數(shù)。

        1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

        取對數(shù)生長期細胞,經(jīng)受試樣品處理后,胰蛋白酶消化,離心收集沉淀,使用細胞裂解液裂解細胞,用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度后,聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉,一抗二抗溫育后,采用ECL顯影液曝光。

        2 結(jié) 果

        2.1 化合物ZP-20f顯著抑制OSCC細胞增殖

        化合物ZP-20f對OSCC細胞株SCC-9和CAL-27的增殖具有較好的體外抑制作用,具有濃度依賴性,IC50分別達到7.66和9.62 nmol/L(表1),與陽性對照藥物CA-4活性相當(dāng)??寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果也顯示,化合物ZP-20f對兩種腫瘤細胞的克隆形成具有顯著的抑制作用(圖2)。

        表 1 化合物ZP-20f、CA-4抑制OSCC細胞SCC-9和CAL-27增殖的IC50Tab. 1 The IC50 values of ZP-20f, CA-4 against SCC-9 and CAL-27

        圖 2 化合物ZP-20f抑制OSCC細胞SCC-9和CAL-27集落的形成并具有濃度依賴性Fig. 2 Compound ZP-20f inhibited SCC-9 and CAL-27 colony formation in a dose-dependent manner

        2.2 ZP-20f可在G2/M期阻滯細胞周期

        為研究ZP-20f對OSCC細胞周期的影響,我們用受試樣品處理細胞后,進行PI染色,并采用流式細胞術(shù)分析細胞中DNA含量,結(jié)果表明,ZP-20f可以顯著誘導(dǎo)G2/M細胞周期阻滯,受試化合物濃度的增加,G2/M期細胞比例隨之增加,呈濃度依賴性(圖3)。

        2.3 ZP-20f可誘導(dǎo)細胞凋亡

        作用于微管-微管蛋白的抗腫瘤藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。為檢測ZP-20f誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,我們用受試樣品處理細胞后,采用PI-Annexin V雙染色法染色后,用流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞比例。結(jié)果顯示,ZP-20f可以顯著誘導(dǎo)CAL-27和SCC-9細胞株凋亡,且具有濃度依賴性(圖4)。

        2.4 ZP-20f調(diào)控細胞周期凋亡相關(guān)蛋白變化

        為進一步研究ZP-20f抗腫瘤作用機制,我們采用Western blot檢測了細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。結(jié)果顯示,ZP-20f濃度依賴的誘導(dǎo)組蛋白3(histone 3)磷酸化的上調(diào)、cyclin B1表達的上調(diào)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]的切割,且具有濃度依賴性(圖5)。

        圖 3 ZP-20f誘導(dǎo)OSCC細胞SCC-9和CAL-27細胞G2/M期阻滯并具有濃度依賴性Fig. 3 ZP-20f induced SCC-9 and CAL-27 cell cycle arrest at G2/M phase in a dose-dependent manner

        圖 4 ZP-20f誘導(dǎo)OSCC細胞SCC-9和CAL-27細胞凋亡并具有濃度依賴性Fig. 4 ZP-20f induced SCC-9 and CAL-27 cellular apoptosis in a dose-dependent manner

        圖 5 ZP-20f調(diào)節(jié)OSCC細胞SCC-9和CAL-27細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達Fig. 5 ZP-20f regulated SCC-9 and CAL-27 cell cycle and apoptosis-related protein

        3 討 論

        化療是臨床治療OSCC的主要手段之一,特別是對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移、失去手術(shù)機會的患者來說,化療幾乎是唯一的治療手段,臨床研究表明,許多化療藥物可以改善預(yù)后,延長患者生存期[5,7]。但腫瘤耐藥性的出現(xiàn)和化療藥物引起的不良反應(yīng)使得現(xiàn)有化療藥物遠不能滿足臨床需求。由于在細胞有絲分裂中的重要作用,微管和微管蛋白現(xiàn)已成為研究抗腫瘤化合物的重要作用靶點。微管蛋白與小分子藥物結(jié)合位點有3個,分別是紫杉醇結(jié)合位點、長春堿結(jié)合位點和秋水仙堿結(jié)合位點。紫杉醇、埃博霉素等結(jié)合于紫杉醇結(jié)合位點,抑制微管解聚成微管蛋白。長春堿、長春新堿結(jié)合于長春堿結(jié)合位點,抑制微管蛋白聚集形成微管。這兩類藥物在臨床上作為抗腫瘤藥物已有廣泛應(yīng)用。作用于秋水仙堿結(jié)合位點尚未有上市的抗腫瘤藥物,CA-4、BNC105等作為抗腫瘤藥物目前正在臨床試驗階段。ZP-20f是根據(jù)CA-4結(jié)構(gòu)改造獲得的小分子化合物,與CA-4相比具有水溶性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點。本研究表明,ZP-20f對口腔鱗癌細胞SCC-9和CAL-27具有較強的體外抑制活性,IC50為7~10 nmol/L,與CA-4作用相當(dāng)。與CA-4、紫杉醇等藥物類似,ZP-20f可以誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G2/M期,主要與其抑制微管形成從而干擾細胞有絲分裂中紡錘體的形成有關(guān)[8-9]。此外,ZP-20f可以上調(diào)組蛋白3的磷酸化水平和cyclin B1的表達。研究表明,cyclin B1在細胞中合成于S期,G2期含量達到最大值,M期被降解[10]。因此G2/M期細胞中cyclin B1含量比正常周期的細胞多。組蛋白3是染色質(zhì)中主要的蛋白組分,組蛋白3的磷酸化是高度保守的,起始于G2期晚期,在染色質(zhì)凝聚時擴散到整個染色體,在有絲分裂結(jié)束時發(fā)生脫磷酸化。因此磷酸化的組蛋白3在G2/M期阻滯的細胞中表達量較高[11]。此外,細胞發(fā)生凋亡時,凋亡核心成員caspase 3被激活,細胞內(nèi)的PARP被切割成cleaved-PARP而失去酶活力。因此細胞中cleaved-PARP量增加可以證明細胞凋亡的發(fā)生[12]。

        綜上所述,本研究表明微管蛋白聚集抑制劑ZP-20f在體外對OSCC細胞的增殖具有良好的抑制作用,且具有濃度依賴性,能阻滯細胞周期于G2/M,誘導(dǎo)細胞凋亡。研究結(jié)果為開發(fā)這類化合物作為治療口腔上皮鱗癌的化療藥物提供了依據(jù)。

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