沈 雁 王章流 鄭華君 鐘繼紅 倪思憶 李 思

作者單位：1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科（杭州310005）；2 浙江省立同德醫(yī)院兒科（杭州310012）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative Colitis，UC）是一種慢性非特異性結(jié)腸炎性疾病，其主要病理特征為黏膜炎癥和潰瘍形成，臨床呈現(xiàn)出反復(fù)發(fā)作和遷延不愈的特點(diǎn)，使其成為消化系統(tǒng)難治性疾病之一[1]。該病在西方國家相當(dāng)常見，歐洲和北美的患病率達(dá)（100～200）/10 萬，但我國近年報(bào)道的病例亦明顯增多，且患者多為青壯年，給社會(huì)生產(chǎn)力和個(gè)人生活質(zhì)量帶來極大影響[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)破壞是引起UC 發(fā)病和病情進(jìn)展的核心事件，而腸上皮細(xì)胞（intestinal Epithelial Cells，IECs）的異常凋亡可能在該事件中起重要的中介作用[3-4]，這一觀點(diǎn)已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并日益成為研究焦點(diǎn)。小檗堿（berberine hydrochloride，BBR）是中藥黃連中的主要活性成分之一。研究表明，BBR 能保護(hù)多種原因引起的腸黏膜屏障損傷[5-7]，且臨床用于治療UC 的效果確切[8]。本研究采用右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sul-phate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC 模型小鼠，通過觀察BBR 對(duì)UC 模型小鼠腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）凋亡的影響，探討B(tài)BR 治療UC 的部分作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康雄性SPF 級(jí)BALB/c 小鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)：0345203。小鼠飲用水為滅菌二級(jí)超純水，質(zhì)量符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB5749-2006）的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對(duì)濕度范圍40～70%。

1.2 主要藥品與試劑 葡聚糖硫酸酯鈉鹽（DSS，MP Biomedicals，LLC，批號(hào)BJ14745，F(xiàn)luka：5000MW）；鹽酸小檗堿（BBR，上海源葉生物，批號(hào)Y18D8C50814，分 子 量：371.81）；Caspase-12 和Cas-pase-3 一 抗（Abcam 公司，批號(hào)分別為：ab62484 和ab13847）；抗兔和抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：K167722B 和K175212C）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K167722A）；TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（ROCHE 公司，批號(hào)11906800）；蛋白酶K（Tiangen公司，批號(hào)M2011）。

1.3 主要儀器 RM2235 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國LEICA 公司），Tec 2500 型病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司），BX43 型顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），BCD-211KD3型冰箱（TCL 公司），C21-SDHC15K 型電磁爐（浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司），101-3 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物混懸液配制 按人—小鼠體表面積換算，分別用蒸餾水配制成低、中、高劑量（100、150、200mg/kg）的BBR 混懸液。

2.2 分組及處理 小鼠適應(yīng)性養(yǎng)殖1 周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、BBR 低、中、高劑量組五組，每組12 只。參照文獻(xiàn)[9]采用DSS 誘導(dǎo)法建立UC 模型：小鼠自由飲用5%DSS 溶液100mL（5g DSS 溶于100mL 蒸餾水中），連續(xù)7d；空白對(duì)照組每天自由飲用蒸餾水（100mL）。BBR 低、中、高劑量組小鼠在造模第1 天起同時(shí)予BBR 混懸液灌胃（給藥容量為10mL/kg），模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水，每天1 次，共7d。

2.3 一般情況觀察 造模之日起，每天觀察并記錄小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)、攝食量和飲水量等一般情況，每天定時(shí)稱量體質(zhì)量，觀察糞便性狀并行隱血試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行疾病活動(dòng)度指數(shù)（disease activity index，DAI），DAI=（體質(zhì)量減輕率分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血程度分?jǐn)?shù)）/3。

2.4 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè) 藥物治療結(jié)束后，全部小鼠以頸部脫臼法處死，嚴(yán)格無菌條件下取出結(jié)腸組織，修整大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm，4%多聚甲醛固定4 天，石蠟包埋，4μm 厚連續(xù)切片，HE 染色后光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，并參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行組織損傷指數(shù)（tissue damage index，TDI）評(píng)分：正常結(jié)腸黏膜為0 分，隱窩腺體丟失1/3 為1 分，隱窩腺體丟失2/3 為2 分，隱窩腺體全部丟失，黏膜上皮完整伴有輕度炎細(xì)胞浸潤為3 分，黏膜上皮糜爛、破壞、伴有明顯炎細(xì)胞浸潤為4 分。每個(gè)樣本于200 倍鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野觀察，記錄并評(píng)分統(tǒng)計(jì)。

2.5 結(jié)腸組織IECs 凋亡情況檢測(cè) 結(jié)腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行操作。主要步驟如下：切片脫蠟入水，蛋白酶K 工作液37℃消化組織20min，PBS 沖洗，加TUNEL 反應(yīng)混合液（含5μL TdT 和45μL 熒光素標(biāo)記的dUTP 標(biāo)記液），加封閉液于暗濕盒中37℃反應(yīng)30min，漂洗，加DAB 底物，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。每張切片于400 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察，記錄并統(tǒng)計(jì)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)。

2.6 結(jié)腸組織Caspase-12 和Caspase-3 蛋白表達(dá)測(cè)定 結(jié)腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行操作。主要步驟如下：切片二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，3%H2O237℃孵育15min，PBS 沖洗，滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗37℃孵育30min，DAB 反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，沖洗、復(fù)染，干燥，封片。每張切片于200 倍鏡下隨機(jī)選取3 個(gè)視野觀察，判讀陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性率。參照Fromowitz 法進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[12]：（1）染色強(qiáng)度（以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分）：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；（2）陽性范圍：＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。計(jì)算兩項(xiàng)結(jié)果之和，＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中度陽性（++），6～7 分為強(qiáng)陽性（+++）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)及Dunnett-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠一般情況和疾病活動(dòng)度變化 造模成功后，模型對(duì)照組和BBR 治療組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神呆滯、行動(dòng)緩慢、進(jìn)食少，伴有大便稀溏、便血、體質(zhì)量下降，而空白對(duì)照組小鼠的精神、活動(dòng)、飲食、大便、體質(zhì)量等一般情況均正常。與模型對(duì)照組比較，BBR 高劑量組的DAI 明顯降低（P＜0.01）；而BBR 低、中劑量組的DAI 雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

3.2 小鼠結(jié)腸組織病理改變 鏡下可見，空白對(duì)照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮未見病變；模型對(duì)照組結(jié)腸可見黏膜下隱窩腺體全部丟失，炎性細(xì)胞浸潤黏膜至上皮結(jié)構(gòu)破壞；BBR 低、中、高劑量組中，以BBR 高劑量組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組最為接近，BBR 低劑量組可見隱窩腺體大片丟失，黏膜下炎細(xì)胞浸潤，部分黏膜上皮可見水腫，BBR 中劑量組與低劑量組比較病變程度有所減輕。與模型對(duì)照組比較，BBR 高劑量組TDI 明顯降低（P＜0.01）；BBR低、中劑量組TDI 雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。見表1、封二圖1。

表1 各組小鼠治療7 天后DAI 和TDI 評(píng)分比較（）

表1 各組小鼠治療7 天后DAI 和TDI 評(píng)分比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△△P＜0.01；DAI：疾病活動(dòng)指數(shù)；TDI：組織損傷指數(shù)；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予蒸餾水；BBR 低劑量組給予BBR 混懸液100mg/kg；BBR 中劑量組給予BBR 混懸液150mg/kg；BBR 高劑量組給予BBR 混懸液200mg/kg；BBR：小檗堿

組別 鼠數(shù) 劑量（mg/kg）DAITDI空白對(duì)照組12-0.06±0.040.00±0.00模型對(duì)照組12-1.50±0.65*3.88±0.04*BBR 低劑量組121001.12±0.53*3.58±0.11*BBR 中劑量組121501.00±0.47*2.98±0.53*BBR 高劑量組122000.48±0.36*△△1.62±0.64*△△

3.3 小鼠結(jié)腸組織IECs 凋亡情況 TUNEL 陽性細(xì)胞呈褐色或深褐色，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞呈藍(lán)色?？瞻讓?duì)照組小鼠結(jié)腸組織偶見凋亡細(xì)胞，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮凋亡細(xì)胞顯著增多，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明IECs 的過度凋亡加重了腸黏膜屏障的損傷；與模型對(duì)照組比較，BBR低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織IECs 凋亡水平均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），表明BBR 能有效抑制UC 模型小鼠結(jié)腸組織IECs 的過度凋亡。見表2、封二圖2。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織IECs 凋亡水平比較（）

表2 各組小鼠結(jié)腸組織IECs 凋亡水平比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；IECs：腸上皮細(xì)胞；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予蒸餾水；BBR 低劑量組給予BBR 混懸液100mg/kg；BBR 中劑量組給予BBR 混懸液150mg/kg；BBR 高劑量組給予BBR 混懸液200mg/kg；BBR：小檗堿

組別 鼠數(shù) 劑量（mg/kg）TUNEL 染色凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)）空白對(duì)照組12-0.67±0.12模型對(duì)照組12-19.27±2.01*BBR 低劑量組121009.67±4.27*△BBR 中劑量組121504.00±1.64*△BBR 高劑量組122002.07±0.92*△△

3.4 小鼠結(jié)腸組織Caspase-12 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平 Caspase-12 和Caspase-3 陽性呈褐色或黃褐色，主要表達(dá)于胞漿。二者均表現(xiàn)為空白對(duì)照組表達(dá)最低，模型對(duì)照組表達(dá)最高，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，BBR 高劑量組Caspase-12 表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01），BBR 中、高劑量組Caspase-3 表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。見表3、封二圖3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織Caspase-12 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組小鼠結(jié)腸組織Caspase-12 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△△P＜0.01；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予蒸餾水；BBR 低劑量組給予BBR 混懸液100mg/kg；BBR 中劑量組給予BBR 混懸液150mg/kg；BBR 高劑量組給予BBR 混懸液200mg/kg；BBR：小檗堿

組別 鼠數(shù) 劑量（mg/kg）Caspase-12Caspase-3空白對(duì)照組12-1.78±0.672.22±0.44模型對(duì)照組12-4.56±0.53*5.33±1.00*BBR 低劑量組121003.00±1.00*4.33±0.71*BBR 中劑量組121503.44±0.73*3.56±1.24*△△BBR 高劑量組122002.33±0.50*△△2.77±1.09*△△

4 討 論

UC 的病因病機(jī)尚不十分明確，既往認(rèn)為可能是包括遺傳、環(huán)境、腸道菌群、免疫等在內(nèi)的多因素共同作用的結(jié)果[13]。目前臨床上UC 的治療藥物主要包括氨基水楊酸類制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等，但存在遠(yuǎn)期療效差、價(jià)格高昂、毒副作用大等問題。因此，深入研究UC 的確切發(fā)病機(jī)制并從發(fā)病根源著手，探尋有效的治療藥物或措施進(jìn)行及時(shí)干預(yù)，是防治UC 發(fā)病和慢性化、重癥化的關(guān)鍵，對(duì)改善患者生命質(zhì)量和有效節(jié)約社會(huì)衛(wèi)生資源具有重要意義。

生理情況下，IECs 的適度凋亡與隱窩基底部腸道干細(xì)胞的分化更新間維持動(dòng)態(tài)平衡，協(xié)同細(xì)胞旁途徑形成穩(wěn)固的防御體系，可有效防止包括病原微生物在內(nèi)的外源性抗原物質(zhì)自由通過。若IECs 異常過度凋亡，將導(dǎo)致腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)損傷，腸上皮通透性增高[14-15]，腸腔內(nèi)的各種抗原異常暴露于固有層黏膜相關(guān)淋巴組織，刺激后者釋放大量的致炎細(xì)胞因子，繼而借助細(xì)胞因子間網(wǎng)絡(luò)化通訊使免疫炎癥反應(yīng)持續(xù)或呈瀑布樣級(jí)聯(lián)放大，最終引起持續(xù)和/或嚴(yán)重的組織損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是真核細(xì)胞中普遍存在且高度保守的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，嚴(yán)重或持續(xù)的ERS 狀態(tài)將啟動(dòng)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)應(yīng)激細(xì)胞程序性死亡[16]。Caspase-12（casteintl aspartates pecific protease-12）是ERS 獨(dú)有的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的起始因子，它僅在ERS 狀態(tài)下激活并進(jìn)一步磷酸化活化下游的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，從而獨(dú)立地介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。IECs 屬于ERS 活躍細(xì)胞，易處于ERS 過度狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，不同應(yīng)激原刺激IECs 所構(gòu)建的體外ERS 模型中普遍存在細(xì)胞異常凋亡現(xiàn)象，使細(xì)胞通透性明顯升高[18-19]；同時(shí)有證據(jù)表明，UC 患者和動(dòng)物模型的的結(jié)腸組織中亦存在大量凋亡的IECs[19-20]。綜上可知，IECs 的凋亡加速是導(dǎo)致腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)破壞、造成UC 結(jié)腸炎癥持續(xù)或加重的重要原因，通過抑制Caspase-12/Caspase-3 凋亡信號(hào)通路的激活而抑制IECs 的過度凋亡可能是治療UC 的有效手段之一。

長期的臨床實(shí)踐證明，中醫(yī)藥治療UC 具有較好的臨床效果和安全性。BBR 又名黃連素，其藥理作用多樣，毒副作用小，價(jià)格低廉，臨床應(yīng)用廣泛。研究證實(shí)，BBR 能減輕慢性應(yīng)激、嚴(yán)重腹腔感染或膿毒血癥等多種病因引起的腸黏膜損傷，保護(hù)腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)[5-7]。BBR 作為輔助藥物治療UC 能促進(jìn)腸黏膜再生，加速潰瘍愈合，明顯降低UC 的復(fù)發(fā)率[8]，目前已知的作用機(jī)制包括調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)[22]、保護(hù)腸屏障功能[23]、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]等，但BBR 是否能通過抑制IECs 的異常凋亡而發(fā)揮治療UC 的作用，目前國內(nèi)外罕見報(bào)道，值得深入探索和闡釋。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)BBR 治療后UC 模型小鼠的臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，DAI 評(píng)分明顯降低，小鼠結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤、上皮水腫、上皮結(jié)構(gòu)破壞及隱窩腺體丟失等組織病理損傷得到了很好的控制，顯示出BBR 良好的臨床療效。UC 模型小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡較正常小鼠顯著增多，說明IECs 凋亡過度參與了UC 的病理過程；BBR 能不同程度地減輕腸細(xì)胞的凋亡水平，提示BBR 能有效抑制UC 時(shí)IECs 的過度凋亡行為。正常小鼠結(jié)腸組織Caspase-12 和Caspase-3 均呈現(xiàn)低表達(dá)，而UC 小鼠的表達(dá)顯著升高，BBR 高劑量治療后Caspase-12 和Caspase-3 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，提示BBR 抑制IECs 過度凋亡的主要機(jī)制可能與抑制Caspase-12/Caspase-3 凋亡信號(hào)通路有關(guān)。因此，BBR 治療UC 具有一定的應(yīng)用前景，但應(yīng)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究BBR 對(duì)IECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，以及其影響UC 腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)的具體作用機(jī)制，挖掘信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，為臨床治療UC 提供新的治療靶標(biāo)和更為有效的藥物。