李曉艷, 遲乃玉, 王一茜

(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622)

0 引 言

半纖維素是自然界中第2大類雜聚多糖,其中β -甘露聚糖是一種主要的半纖維素。甘露聚糖廣存在于槐豆膠、瓜爾豆膠、魔芋精粉和其他植物多糖中[1],β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase,EC 3.2.1.78)能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的多聚糖(如均一甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖)為甘露低聚糖的酶[2]。甘露低聚糖有良好的生物調(diào)節(jié)功能,能夠有效降低人體血糖[3]、膽固醇,作為雙歧因子能夠促進腸道中雙歧桿菌的生長,改善菌群結(jié)構(gòu),減少有害細菌的產(chǎn)生,是良好的食品添加劑[4]。作為一種新型工業(yè)用酶,β -甘露聚糖酶酶廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、紡織印染、石油開采和生物學(xué)研究等諸多方面[4-7]。

β -甘露聚糖酶廣泛存在于植物、動物、人類的腸道中,但微生物來源的酶具有成本低,生產(chǎn)周期短、產(chǎn)酶活性高的特點,多年來一直是國內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點。國內(nèi)外研究主要集中在中高溫產(chǎn)酶菌株的選育[1,8]、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[9-11]、酶的制備工藝優(yōu)化[12-13]、酶基因克隆與表達[14-16]等方面。國外(Yutaka Tamaru,O.Politz)[17-18]對海洋細菌β -甘露聚糖酶基因進行研究,國內(nèi)張云光等[19]對海洋細菌β -甘露聚糖酶進行菌株篩選研究,得到最適作用溫度30 ℃產(chǎn)酶菌株。低溫酶具有低溫高催化活性、高效結(jié)構(gòu)柔順性、熱不穩(wěn)定性等特點,使其在應(yīng)用上比中溫酶、高溫酶更有優(yōu)勢。近幾年來,低溫脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶等多種低溫酶已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),低溫β -甘露聚糖酶研究與開發(fā)是大勢所趨。

本文以遼寧省海洋微生物工程技術(shù)中心從海泥中篩選的產(chǎn)低溫β -甘露聚糖酶的類芽孢桿菌WY-01為研究對象,通過單因素實驗,對其產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行研究,提高其產(chǎn)酶量,為低溫β -甘露聚糖酶的酶學(xué)特性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株:類芽孢桿菌WY-01篩選自海泥,保藏至遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基(g/L):瓜豆膠 10,瓊脂粉15,氯化鈉20,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉 10,酵母膏5,蛋白胨3,硫酸鎂0.3,氯化鉀5,磷酸氫二鉀1,硫酸亞鐵0.01,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉5,蛋白胨5,磷酸氫二鉀1,氯化鈉10,氯化鉀6,硫酸鎂5,pH自然,115 ℃ 0.056 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器:魔芋粉、瓜豆膠、蛋白胨、酵母膏等購自Sigma公司,其他試劑均為分析純試劑;LRH系列培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋,購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱,購自武漢建偉生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌株活化:用滅菌的牙簽挑取保存菌株接種于固體種子培養(yǎng)基,置于恒溫培養(yǎng)箱中,25 ℃培養(yǎng)活化。

1.2.2 種子培養(yǎng):挑取單菌落接種于5 mL液體種子培養(yǎng)基中,于25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。按3%接種量將一級種子液接入100 mL液體種子培養(yǎng)基,于25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h為二級種子液。

在線條上，畫面下半部分我都是選擇一些比較圓滑的線條，例如海面上的波浪，沙灘上的波紋。而畫面上半部分我則是選擇了一些頓一些、起伏不太明顯的線條來維持整個畫面的對比關(guān)系。但是這些線條也遠遠不夠，所以我還在這些線條的基礎(chǔ)上做了其他的更微妙的線條，例如畫面中的人物、花草及鳥類。這樣一些細小的、微妙的線條也能打破之前的一些形狀，這樣的碰撞對于整個畫面來說也是好的。在初期定草圖的時候，我將海浪的起伏感、立體感定位重點之一，將其起伏變化都進行了反復(fù)修改，線條的穿插、長短都是畫面成功與否的關(guān)鍵。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng):按3%接種量將二級種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h。

1.3 酶活的測定方法

1.3.1 底物的處理:粗魔芋粉中含有還原糖,需進行預(yù)處理使其變?yōu)榫в蠓?測定酶活時作為底物使用。將魔芋粉浸泡于75%酒精中,24 h后換酒精,再浸泡4 d,用斐林試劑檢測無還原糖后,加入pH 6.0的磷酸鈉緩沖溶液中備用[20]。

1.3.2 制備粗酶液

250 mL的錐形瓶中配制100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,以3%的接種量接種,25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h,用1 mL移液槍從發(fā)酵培養(yǎng)基中取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL Tube管,4 ℃ 8 000 r/min離心10 min,上清液為粗酶液。

1.3.3 酶活的測定(DNS法)

在0.9 mL底物(將魔芋粉溶于pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中配制20 g/L的溶液作為底物)中加入0.1 mL的粗酶液,50 ℃水浴反應(yīng)10 min。加入DNS試劑2.0 mL,沸水浴5 min顯色,立即以流動水冷卻至室溫,加去離子水定容至10.0 mL,以空白液調(diào)零,在540 nm處測定吸光度。酶活力定義:每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 碳源種類:配制碳源種類分別為0.6%的魔芋粉、淀粉、麥芽、蔗糖、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

1.4.2 碳源濃度:魔芋粉為最佳碳源,濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

1.4.4 有機氮源濃度:以蛋白胨作有機氮源,濃度設(shè)定為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%配制培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

無機氮源濃度:磷酸氫二銨作無機氮源,濃度設(shè)定為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%配制培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

1.4.5 有機氮源和無機氮源比例(復(fù)合氮源):以蛋白胨為有機氮源、磷酸氫二銨為無機氮源,有機氮源和無機氮源比例(復(fù)合氮源)設(shè)定為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h后用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

1.4.6 無機鹽種類:在上述最佳優(yōu)化條件下,0.02%的Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后接種3%的二級種子培養(yǎng)液25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h用DNS法測定酶活,每個處理做3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類及最佳碳源濃度對產(chǎn)酶的影響

圖1 碳源種類對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon source kinds on enzyme production

對異養(yǎng)微生物來說,糖類物質(zhì)能夠提供碳素來源同時具有能源功能,不但影響菌株的生長,而且影響菌株代謝產(chǎn)物的形成。微生物碳源譜雖廣,但對異氧微生物來說,利用糖類物質(zhì)的一般規(guī)律是單糖優(yōu)于雙糖和多糖。由圖1可知,多糖為魔芋粉和淀粉,雙糖為蔗糖、麥芽糖,單糖為葡萄糖。在5種碳源物質(zhì)中,菌株以魔芋粉為主要碳源,其發(fā)酵產(chǎn)生的β -甘露聚糖酶的量明顯比其他4種碳源高,其酶活最高為127.71 U/mL,碳源物質(zhì)為淀粉時酶活最低為32.2 U/mL。由此可見,多糖魔芋粉為其最優(yōu)碳源。一方面是由于魔芋粉能提供碳素營養(yǎng)兼具能源功能,進而影響細菌WY-01的生長;另一方面β -甘露聚糖酶是菌株生理代謝的產(chǎn)物,它的產(chǎn)生需要魔芋粉作為誘導(dǎo)物進行誘導(dǎo)才能產(chǎn)生此酶。

圖2 不同濃度魔芋粉對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on enzyme production

由圖2可知,在魔芋粉濃度為0.2%～0.6%時,酶活隨著魔芋粉濃度的升高而增大,0.6%時酶活達到最大值為274.65 U/mL;在魔芋粉濃度0.6%～1.0%時,酶活隨著濃度的升高而降低。在魔芋粉濃度為0.2%時,酶活最低為220.41 U/mL。魔芋粉做為最佳碳素營養(yǎng)物質(zhì),含有葡苷聚糖。葡苷聚糖吸水性,粘性較強。發(fā)酵培養(yǎng)基中魔芋粉濃度過高,且具有較強的吸水性和粘性,使菌株生長環(huán)境的滲透壓變大,菌株因環(huán)境滲透壓變大而失去水分,影響菌株的生長和代謝產(chǎn)物的形成,影響β-甘露聚糖酶的合成及其產(chǎn)量;魔芋粉濃度過低,則菌株由于營養(yǎng)物質(zhì)不足而影響生長與β -甘露聚糖酶的形成,進而影響產(chǎn)酶量,由此可確定發(fā)酵培養(yǎng)基中魔芋粉最佳濃度為0.6%。

2.2 氮源種類及最佳氮源濃度對產(chǎn)酶的影響

圖3 氮源種類對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source kinds on enzyme production

氮源作為構(gòu)成細菌生命的大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)的主要營養(yǎng)物質(zhì),用來合成微生物細胞物質(zhì)和含氮代謝物。微生物氮源譜廣,分為無機氮源和有機氮源,無機氮源一般為速效性氮源,一般在菌體生長時吸收利用,菌體吸收快利于生長;有機氮源為遲效性氮源,一般在菌株形成次級代謝產(chǎn)物時利用,利于菌體代謝產(chǎn)物的形成。在發(fā)酵過程中選擇合適種類有機氮源、無機氮源、或有機氮源與無機氮源比例即復(fù)合氮源種類及比例尤為重要。由圖3可知,在4種有機氮源中,蛋白胨為最佳有機氮源,酶活最高達269.69 U/mL;在5種無機氮源中,磷酸氫二銨為最佳無機氮源,酶活最高達254.15 U/mL。類芽孢桿菌WY-01在發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長期以吸收無機氮磷酸氫二銨為其主要氮源滿足菌體生長需求,在β -甘露聚糖酶的形成時,以蛋白胨為有機氮源滿足產(chǎn)物的需求。

由圖4可知,在蛋白胨濃度為0.1%～0.2%時,酶活隨濃度的升高而增大,0.2%達到最大值為228.25 U/mL;在蛋白胨0.3%～0.4%,隨濃度升高,酶活下降,0.3%時酶活最低為172.46 U/mL。由此可確定最優(yōu)單一有機氮源蛋白胨的濃度為0.2%。

由圖5可知,在磷酸氫二銨濃度為0.1%～0.2%時,酶活隨濃度升高而增大,在磷酸氫二銨濃度為0.2%時酶活達到最大值為204.15 U/mL,在磷酸氫二銨濃度為0.3%～0.4%,酶活隨濃度升高而下降。磷酸氫二銨濃度0.1%時酶活最低為126.53 U/mL。由此確定最優(yōu)單一無機氮源磷酸氫二銨濃度為0.2%。

圖4 不同濃度蛋白胨對產(chǎn)酶的影響

圖5 不同濃度磷酸氫二銨對產(chǎn)酶的影響

圖6 復(fù)合氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of complex nitrogen source on enzyme production

有機氮源選用蛋白胨,無機氮源選用磷酸氫二銨,且有機氮源與無機氮源比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。由圖6可知,復(fù)合氮源對產(chǎn)酶影響較大,當有機氮與無機氮的比例為3∶1時,酶活最高達246.24 U/mL;2∶1時酶活最低為170.98 U/mL。由此可確定復(fù)合氮源中有機氮源和無機氮源最優(yōu)比例為3∶1。有機氮蛋白胨富含有機含氮的化合物,也含有糖類和一些維生素等營養(yǎng)成分,為類芽孢桿菌WY-01提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子,有機氮源的物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,菌株利用較慢為遲效性氮源,在發(fā)酵不同階段不同程度影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的形成。無機氮源的物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單、利用快捷,可做速效性氮源,但在發(fā)酵后期,隨著無機氮中的銨鹽被吸收殆盡,發(fā)酵液中的pH值也會隨之降低酸化,改變環(huán)境中pH,對酶的合成有一定的阻遏作用,而一定量有機氮源的存在,在不同程度上對環(huán)境pH改變有一定緩沖作用,同時促進代謝產(chǎn)物的形成,所以復(fù)合氮源效果最佳,優(yōu)化最優(yōu)的比例能更好的促進菌株生長及代謝產(chǎn)物的形成。

2.3 無機鹽種類對產(chǎn)酶的影響

圖7 無機鹽種類對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inorganic salt kinds on enzyme production

由圖7可知,6種無機鹽離子中,Fe2+對酶活明顯無作用,Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+對酶活有一定促進作用,統(tǒng)計分析表明, K+和Mg2+對酶活影響顯著。無機鹽是微生物生長必須的元素,一些無機鹽構(gòu)成細胞內(nèi)一般分子成分;一些無機鹽作為生理調(diào)節(jié)物質(zhì)。有些無機鹽作為微生物酶的激活劑,作用于微生物酶的活性部位,促進酶制劑的產(chǎn)生;有些無機鹽作為酶的抑制劑,對產(chǎn)酶起一定程度的抑制作用。無機鹽是影響產(chǎn)酶的重要因素。

2.4 在上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下類芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活測定

對類芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶菌株培養(yǎng)基通過單因素實驗研究魔芋粉濃度為0.6%,復(fù)合氮源濃度為0.2%,復(fù)合氮源蛋白胨與磷酸氫二銨的比例為3∶1,氯化鈉0.1%,氯化鉀0.6%,硫酸鎂0.5%,在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下產(chǎn)酶活力達到276.24 U/mL,未優(yōu)化前酶活最大為168.71 U/mL,是優(yōu)化前的1.64倍。

3 結(jié) 論

對類芽孢桿菌WY-01發(fā)酵生產(chǎn)低溫β -甘露聚糖酶的培養(yǎng)基進行單因素實驗,從碳源種類、碳源的濃度,氮源種類、氮源濃度、有機氮源與無機氮源的比例、無機鹽種類進行優(yōu)化,提高其產(chǎn)酶量。結(jié)果表明:最佳碳源為魔芋粉,濃度為0.6%;最佳有機氮源為蛋白胨,濃度為0.2%,無機氮源為磷酸氫二銨,濃度為0.2%,有機氮源與無機氮源的比為3∶1。統(tǒng)計分析表明:Fe2+、Na+、Ca2+、Zn2+對產(chǎn)酶影響不顯著,K+和Mg2+對產(chǎn)酶影響顯著。在上述最佳營養(yǎng)條件下酶活力達276.24 U/mL,未優(yōu)化前酶活最大為168.71 U/mL,是優(yōu)化前的1.64倍,這一結(jié)論為類芽孢桿菌WY-01后期的發(fā)酵放大與潛在的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。