包瑩玲，趙威棣，呂旭浩，周靖陽(yáng)，祝衢鑫，李 忠，陳小龍

（1．浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州310014；2．浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司，浙江 杭州311500）

烷基間苯二酚（Alkylresorcinols）是一種具有兩親性的酚醛脂類次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要存在于植物、真菌及細(xì)菌中。在微生物中，烷基間苯二酚與其環(huán)境脅迫響應(yīng)及拮抗作用有關(guān)［1］。在植物中，烷基間苯二酚有提高生物膜穩(wěn)定性和通透性、保護(hù)植物免受氧化應(yīng)激損傷以及產(chǎn)生化感物質(zhì)等生理功能［2］。在哺乳動(dòng)物中，烷基間苯二酚尤為重要，具有抗氧化、抑制脂氧合酶活性、抗癌和保護(hù)心腦血管等多種藥理學(xué)功能［3］。隨著研究的深入，烷基間苯二酚的生理功能不斷得到闡明，已發(fā)展成一種新型的功能性因子，在食品、醫(yī)療和農(nóng)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

烷基間苯二酚合酶（Alkylresorcinol synthases，ARS）屬于研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要模式分子——Ⅲ型聚酮合酶家族，其可催化脂肪酰CoA和丙二酰CoA進(jìn)行脫羧、縮合、環(huán)化生成烷基間苯二酚。由于具有獨(dú)特的底物識(shí)別和催化機(jī)制，ARS及其所屬的PKS家族為人們進(jìn)行酶的結(jié)構(gòu)與功能研究提供了空前契機(jī)，成為新型藥物研究和開(kāi)發(fā)的理想材料［4］。定向進(jìn)化及高通量篩選是獲得酶優(yōu)異突變體常用的方法之一［5，6］。本研究在成功實(shí)現(xiàn)ARS在溫控自裂解大腸桿菌異源表達(dá)的基礎(chǔ)上，結(jié)合易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)隨機(jī)突變構(gòu)建ARS突變文庫(kù)，并通過(guò)高通量篩選獲得酶活力提高的突變ARS。在此基礎(chǔ)上，對(duì)突變ARS進(jìn)行底物選擇性和酶動(dòng)力學(xué)研究。研究結(jié)果不僅有助于深入探究ARS的催化機(jī)制，而且對(duì)進(jìn)一步改造酶分子、擴(kuò)大酶的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 菌株、質(zhì)粒

宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）和可溫控誘導(dǎo)裂解大腸桿菌的雙控質(zhì)粒pBM1230－ars均由實(shí)驗(yàn)室保存或構(gòu)建。質(zhì)粒pBM1230－ars主要包括：1）由溫控啟動(dòng)子λcI857／pRpL串聯(lián)噬菌體裂解基因SRRz構(gòu)成的溫控裂解元件；2）由lac啟動(dòng)子串聯(lián)多克隆位點(diǎn)構(gòu)成的IPTG（Isopropyl－β－D－thiogalactopyranoside）調(diào)控目的基因表達(dá)元件兩部分。質(zhì) 粒 pBM1230－ars 中 的 ars 基 因 （GenBank：Sb08g003170）來(lái)源于高粱，通過(guò)在線軟件 Gen－Script［7］進(jìn)行針對(duì)大腸桿菌密碼子的偏好性分析及低使用率密碼子同義轉(zhuǎn)化后［8］，交由青蘭生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1．1．2 酶和試劑

質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和蛋白純化試劑盒等均購(gòu)于生工生物工程公司；隨機(jī)突變?cè)噭┖匈?gòu)于美國(guó)安捷倫公司；高保真酶、一步克隆試劑盒和定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)于諾唯贊生物科技公司（南京）；丙二酰－CoA、IPTG、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和固藍(lán)RR鹽購(gòu)于生工生物工程公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。脂肪酰－SNAC的合成基于Gilber方法［9］。引物合成和基因測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物有限公司完成，引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 易錯(cuò)PCR及定點(diǎn)隨機(jī)突變的PCR引物列表1）Table 1 PCR prime for the error－prone PCR and site－random mutation

1．1．3 培養(yǎng)基

LB（Amp）培養(yǎng)基：蛋白胨10g／L，酵母粉5g／L，NaCl 10g／L，Amp 0．05g／L，pH 7．5，Amp與IPTG由0．22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，其他培養(yǎng)基成分均在121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基加入1．5%～2%的瓊脂粉。

1．2 突變文庫(kù)的構(gòu)建

1．2．1 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pBM1230－ars為 模板，以 Ep－ars－F 和Ep－ars－R為引物，通過(guò)隨機(jī)突變?cè)噭┖袑?duì)目的基因進(jìn)行易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增。以 Ep－vec－F 和Ep－vec－R 為引物，通過(guò)高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將質(zhì)粒pBM1230－ars線性化。將PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，并通過(guò)快速克隆試劑盒基于同源臂進(jìn)行同源重組環(huán)化質(zhì)粒。將環(huán)化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布固體 LB（Amp）平板，挑選陽(yáng)性克隆構(gòu)建易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)。

1．2．2 定點(diǎn)隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建

以易錯(cuò)PCR獲得的質(zhì)粒pBM1230－ars（Ep－2）為模板，采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變，分別 以 Sd－ars－F，Sd－ars－R，Sd－vec－F 和 Sd－vec－R 為引物，進(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變擴(kuò)增。成功擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用DpnI酶消化，以去除甲基化模板質(zhì)粒，消化后產(chǎn)物可直接通過(guò)同源臂進(jìn)行同源重組環(huán)化質(zhì)粒。將環(huán)化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布固體LB（Amp）平板，挑選陽(yáng)性克隆組成定點(diǎn)隨機(jī)突變體庫(kù)。

1．3 突變體文庫(kù)的雙控誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性克隆接種于每孔裝有200μL LB（Amp）培養(yǎng)基的96孔板中，30℃，200r／min培養(yǎng)過(guò)夜后，將20μL菌液接種于另一含有180μL LB（Amp）培養(yǎng)基的96孔板中，30℃，200r／min培養(yǎng)4h，加入終濃度為0．8mmol／L的IPTG于30℃誘導(dǎo)ARS表達(dá)4h后，升溫至38℃熱誘導(dǎo)裂解蛋白SRRz表達(dá)2h，最后將培養(yǎng)溫度降至30℃繼續(xù)裂解培養(yǎng)3h［10］。雙控誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于5 000 g離心5min后，收集上清液并加入等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，真空干燥后得到黃色油狀產(chǎn)物用于突變文庫(kù)篩選。

1．4 突變文庫(kù)的高通量篩選

向含有提取產(chǎn)物的96孔板中加入固藍(lán)RR鹽工作液，以V（乙酸）∶V（甲醇）＝1∶99的混合液為溶劑，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．05%的固藍(lán)RR鹽儲(chǔ)液，按V（固藍(lán)RR鹽儲(chǔ)液）∶V（甲醇）＝1∶4配制工作液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的K2CO3溶液為堿化劑，調(diào)節(jié)pH為10，室溫下反應(yīng)15min，烷基間苯二酚與固藍(lán)RR鹽特異性結(jié)合呈紫紅色化合物，于酶標(biāo)儀（Spectra Max M2，美國(guó) Molecular Devices公司）上測(cè)定OD480并保存數(shù)據(jù)。以重組菌E．coli BL21（DE3）／pBM 1230－ars作為對(duì)照，將結(jié)果高于陽(yáng)性對(duì)照的克隆挑出。

1．5 蛋白質(zhì)分離純化及突變酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

將篩選到的ARSSd－3接于50mL LB（Amp）培養(yǎng)基中進(jìn)行雙控誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將培養(yǎng)液于5 000 g離心5min，收集上清液，采用蛋白純化試劑盒中的Ni－柱純化ARS，并經(jīng)透析和蛋白超濾管濃縮后用于酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。

ARS酶活力單位（U）定義：每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 5－烷基間苯二酚所需的酶量。以0．3mmol／L棕櫚酰－SNAC（（C16∶0）－SNAC）為起始底物，以0．7mmol／L丙二酰－CoA為延伸底物，加入20μL粗 酶 液，以 50mmol／L，pH 7．0 的 K2HPO4－KH2PO4緩沖液補(bǔ)足200μL，于30℃反應(yīng)60min。通過(guò)添加50μL甲醇終止反應(yīng)并萃取產(chǎn)物［11］。13 000r／min離心1min，分離上層有機(jī)相，真空干燥后收集產(chǎn)物，并采用高效液相色譜法測(cè)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)［12］。HPLC 檢測(cè)條件：安捷倫 Zorbax SB－C18反相色譜柱（250mm×4．6mm，5μm）。流動(dòng)相：線性梯度洗脫，50%～100%甲醇－水（含體積分?jǐn)?shù)為0．1%的三氟乙酸），10min；等強(qiáng)度洗脫，100%甲醇，5min。流速1mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)286nm。在底物特異性試驗(yàn)中，除（C16∶0）－SNAC外，另選取其他脂肪酰－SNAC（月桂酰（C12∶0）－SNAC、肉蔻酰（C14∶0）－SNAC、肉蔻油酰（C14∶1）－SNAC、棕櫚油酰（C16∶1）－SNAC、硬脂酰（C18∶0）－SNAC）作為底物，考察ARSSd－3底物特異性。

1．6 突變酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和突變位點(diǎn)分析

以來(lái)源于Freesia hybrid的聚酮合酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB∶4WUM）為模板［13］，采用 SWISS－MODEL在線分析服務(wù)器（http：／／swissmodel．expasy．org），對(duì)ARS的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，并通過(guò)VMD分析ARS的結(jié)構(gòu)，推測(cè)氨基酸突變點(diǎn)在酶蛋白空間結(jié)構(gòu)中的位置以及對(duì)酶蛋白功能可能造成的影響。

1．7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)顯著性分析采用Excel和SPSS 18軟件進(jìn)行，其中多重比較基于Duncan法進(jìn)行。以P＜0．05，P＜0．01及P＜0．001分別表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異、差異顯著和差異極顯著。酶動(dòng)力學(xué)分析采用 GraphPad prism 7．0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2．1 易錯(cuò)PCR的突變結(jié)果

經(jīng)過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR及單次庫(kù)容量達(dá)到5 000以上的高通量篩選，篩選得到的4株突變ARS表現(xiàn)出比野生ARS更高的酶活性（表2）。通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，除ARSEp－4外，其余的酶活力均顯著提高（P＜0．05）。其中，包含266位點(diǎn)和256位點(diǎn)等2個(gè)突變位點(diǎn)的ARSEp－2酶活性最高，達(dá)到野生ARS的1．23倍。此外，ARSEp－1也包括2個(gè)突變位點(diǎn)，而ARSEp－3則包括1個(gè)突變位點(diǎn)。

表2 兩輪易錯(cuò)PCR篩選及基因測(cè)序結(jié)果Table 2 Screening results and gene sequencing of mutant strains for error－prone PCR

2．2 定點(diǎn)隨機(jī)飽和突變結(jié)果

2．2．1 基于模型的突變位點(diǎn)選擇

ARS與所選的模板序列相似度為46%，序列同源性為54%，序列的覆蓋率為0．94，符合建模要求。根據(jù)SWISS－MODEL自帶系統(tǒng)對(duì)構(gòu)造的同源模型進(jìn)行打分，GMQE為0．76，QMEAN 為－2．03，說(shuō)明用該模型進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)是可靠的。

根據(jù)ARS模型（圖1）對(duì)3個(gè)突變體共涉及的5個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：199位點(diǎn)和228位點(diǎn)的氨基酸位于活性中心附近；256位點(diǎn)的氨基酸位于蛋白表面，推測(cè)該位點(diǎn)氨基酸的對(duì)ARS的結(jié)構(gòu)有一定的影響；207位點(diǎn)和266位點(diǎn)的氨基酸均位于ARS活性中心腔內(nèi)，這對(duì)聚酮鏈的延伸長(zhǎng)度以及起始底物和產(chǎn)物的特異性具有決定作用。由于256，199和228位點(diǎn)遠(yuǎn)離活性腔，故選取207和266兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行下一步的定點(diǎn)飽和突變改造。

圖1 ARS的蛋白質(zhì)建模分析圖Fig．1 The 3Dmodel analysis of ARS

2．2．2 定點(diǎn)隨機(jī)突變文庫(kù)的篩選

對(duì)突變型Ep－2的位點(diǎn)207和266的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變，篩選庫(kù)容量均達(dá)到5 000以上，共篩選到3個(gè)酶活性提高的突變 ARSSd－1，ARSSd－2和ARSSd－3。通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，各突變ARS酶活力均顯著提高（P＜0．001）。如表3所示，酶活性最高的ARSSd－3，其酶活力達(dá)到ARS的1．55倍。

表3 定點(diǎn)隨機(jī)突變文庫(kù)篩選結(jié)果Table 3 Screening results and gene sequencing of mutant for of site random mutation

2．3 野生型和突變體酶學(xué)性質(zhì)表征

2．3．1 ARSSd－3底物特異性表征

以ARS為參照，考察突變ARS對(duì)不同起始底物的底物特異性，結(jié)果如圖2所示：ARS與ARSSd－3一樣，對(duì)不同長(zhǎng)度及飽和度的脂肪酰－SNAC均能進(jìn)行催化，且酶活均有所提升。與Cook等［14］以脂肪酰－CoA為起始底物進(jìn)行底物選擇性研究的結(jié)果相似，ARS偏向于選擇碳鏈長(zhǎng)度中等的（C14∶0）－SNAC為底物，且隨著鏈長(zhǎng)的增加，比酶活力迅速下降。ARSSd－3的底物范圍略有增加時(shí)，也能很好地催化（C16∶0）－SNAC，這可能與活性腔中266位氨基酸的特異性進(jìn)化與在不破壞酶的催化力的前提下快速實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物多樣性有關(guān)［15］。此外，當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度相等時(shí)，ARS和ARSSd－3均更偏向于選擇不飽和度為1的脂肪酰－SNAC。

圖2 不同起始底物對(duì)ARSSd－3酶活力的影響Fig．2 Enzymatic activities of ARSSd－3on different starter molecule－SNAC

2．3．2 ARSSd－3酶動(dòng)力學(xué)分析

以（C16∶0）－SNAC 為起始底物，以丙二酰CoA為延伸底物，以ARS為參照，對(duì)ARSSd－3的酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。如圖3所示，ARSSd－3的反應(yīng)速度顯著高于ARS。當(dāng)?shù)孜铮–16∶0）－SNAC的濃度大于50μmol／L時(shí)，ARS和 ARSSd－3的酶促反應(yīng)速率逐漸增大到最大值。

圖3 不同底物濃度下的ARS和ARSSd－3的反應(yīng)速度Fig．3 The reaction velocity of ARS and ARSSd－3with different（C16∶0）－SNAC concentration

通過(guò) Michaelis－Menten方程分別對(duì)ARS和ARSSd－3的酶促反應(yīng)進(jìn)行擬合，模型的決定系數(shù)R2均大于90%，可用于對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。ARS的米氏常數(shù)Km為（8．9±1．3）μmol／L，最大反應(yīng)速率Vmax為（176．9±6．0）pmol／（min·mmol）；ARSSd－3的Km為（6．8±1．3）μmol／L，Vmax為（234．1±9．8）pmol／（min·nmol）。ARSSd－3的Km值相較于 ARS有明顯的降低，說(shuō)明酶對(duì)底物的親和力增強(qiáng)，更接近于 ARS和天然底物（C16∶0）－CoA的Km值（2．3±1．3）μmol／L［14］。此外，ARSSd－3的Vmax值均高于ARS，表明其催化活力有所提高。

3 結(jié) 論

通過(guò)結(jié)合易錯(cuò)PCR技術(shù)、定點(diǎn)隨機(jī)突變技術(shù)和96孔板通量篩選技術(shù)，對(duì)ARS進(jìn)行定向化分子改造，得到1株包含3個(gè)突變位點(diǎn)（A207S，M266A和T256S）的酶活顯著提高的突變體ARSSd－3，表征后發(fā)現(xiàn)不僅其酶活提高至野生型的1．55倍，底物選擇性向長(zhǎng)鏈脂肪酰SNAC也略有偏移。此外，酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)：ARSSd－3的 Km為（6．8±1．3）μmol／L，對(duì)底物的親和力增強(qiáng)；Vmax為（234．1±9．8）pmol／（min·nmol），催化活力有所提高。本研究有助于深入理解ARS的催化機(jī)制，為后續(xù)利用理性設(shè)計(jì)手段改造ARS，實(shí)現(xiàn)ARS的發(fā)酵生產(chǎn)提供了參考。