嚴燕兵，肖延銘，華 超，金 力，袁 圍

（1．長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長興313100；2．浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州310014）

金針菇菌絲體（Mycelium of Flammulina velutipes）是金菌靈膠囊的主要原料。長興制藥股份有限公司最早開發(fā)制成的金菌靈膠囊具有扶正固本和調(diào)補氣血的功能，主要用于治療中醫(yī)氣血兩虛癥和被西醫(yī)評判為肺癌癥的患者。目前，受生產(chǎn)金針菇菌絲體的發(fā)酵原料大幅漲價的影響，發(fā)酵后的菌粉售價已由2010年的100元／kg上升至2017年的200元／kg。利用現(xiàn)有的發(fā)酵工藝，每升培養(yǎng)液獲得的金針菇菌絲體干重為16～20g，腺苷質(zhì)量分數(shù)為150～200μg／g，這兩項指標均處于較低水平，進一步增加了發(fā)酵成本［1］。因此，開展金針菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝研究，降低發(fā)酵成本，提高金針菇菌絲體的發(fā)酵產(chǎn)能，已經(jīng)成為企業(yè)的迫切任務(wù)。工業(yè)化金針菇菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)時，多采用發(fā)酵工業(yè)用粗料培養(yǎng)基，盡管采用這種方法可以獲得較高的菌絲體得率，但是和水溶性碳源、氮源比較，天然來源的粗料培養(yǎng)基存在水溶性差、成分復(fù)雜的弊端［3－4］。針對以上情況，筆者研究了不同的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基組成對金針菇菌絲體生物量的影響，為金針菇液體生產(chǎn)發(fā)酵成本的降低和菌絲體菌粉質(zhì)量穩(wěn)定性的提升奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

1．1．1 菌 種

金針菇菌種：由長興制藥股份有限公司研發(fā)中心菌種庫保藏。

1．1．2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA）：購于BD公司（美國BD公司，Becton，Dickinson and Company）的PDA 粉末，稱取39g溶于1L水中，pH自然。

碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1．5g／L，大豆蛋白胨20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO43g／L。

氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1．5g／L，膨化玉米粉20g／L，KH2PO43g／L，蔗糖20g／L。

碳源篩選：蔗糖、葡萄糖、膨化玉米粉和可溶性淀粉。

氮源篩選：低溫黃豆粉、中溫黃豆粉、高溫黃豆粉、大豆蛋白胨、花生餅粉和玉米漿干粉。

1．2 試驗方法

1．2．1 斜面菌種制備

將取自金針菇冷凍甘油管的菌種在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基PDA上，恒溫25℃培養(yǎng)7～10d，挑選菌落生長狀況良好、無污染的斜面菌種，冷藏保存在4℃冰箱，備用。

1．2．2 最佳碳源、氮源的篩選

在500mL三角瓶中加入碳源10g／L，氮源10g／L和玉米漿干粉10g／L，KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至100mL，混合充分后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至7．2～7．3，121℃滅菌30min，降溫冷卻，在無菌條件下將斜面培養(yǎng)基中的菌種用接種鏟鏟出一塊1cm2左右的菌種塊，切碎，平均接種于各搖瓶，25℃，150r／min搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1周，觀測金針菇菌絲生長情況，過濾出菌絲體，烘干測干重，采用液相色譜檢測菌絲中腺苷含量。

1．2．3 正交試驗

以各單因素試驗最佳條件為基礎(chǔ)，選擇低溫黃豆粉、玉米漿干粉、膨化玉米粉和蔗糖4個因素，進行4因素3水平的培養(yǎng)基濃度優(yōu)化設(shè)計。正交試驗設(shè)計依據(jù)L9（34）正交試驗表完成，主要參考指標為腺苷質(zhì)量分數(shù)和菌絲體質(zhì)量濃度，確定金針菇菌絲體發(fā)酵最適合的培養(yǎng)基濃度的組合。每組試驗重復(fù)3次，試驗水平和因素如表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment g／L

1．2．4 成品指標

1）性狀：呈淺黃色至棕褐色細粉，氣微香，味淡。

2）水分指標：減失重量不得超過5．0%。

測定方法：取本品2．0g，精密稱定，105℃干燥至恒重。

3）含量指標：本品腺苷質(zhì)量分數(shù)（C10H13N5O4）不小于100μg／g。

測定方法：高效液相色譜法（中國藥典2000年版一部附錄Ⅵ D）［11］。

1．2．5 200L發(fā)酵驗證

1）種子搖瓶制備

在1 000mL三角瓶中加入篩選后的碳源和氮源，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L，蔗糖30g／L，以及 KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至200mL，混合充分后，用氨水調(diào)pH 至7．2～7．3，121℃滅菌30min。降溫冷卻，在無菌條件下將斜面培養(yǎng)基中的菌種用接種鏟鏟出一塊1cm2左右的菌種塊，切碎，平均接種于各搖瓶，25℃，150r／min搖床培養(yǎng)1周，對菌絲生長情況進行觀測，挑選長勢良好的作為種子搖瓶，備用。

2）發(fā)酵驗證

在200L發(fā)酵罐中加入篩選后的碳源和氮源，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L和蔗糖30g／L，以及 KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至120L，混合充分，用氨水調(diào)pH值至7．2～7．3，121℃滅菌30min。降溫冷卻，將種子搖瓶的菌種接種至發(fā)酵罐，接種量為15%，轉(zhuǎn)速200r／min，25℃培養(yǎng)，通氣量為1．0m3／（m3·min）。每隔12h取樣檢測還原糖含量和氨態(tài)氮含量，還原糖質(zhì)量濃度小于10g／L時放罐，過濾發(fā)酵液，收集菌絲體，烘干，打成粉末，檢測金針菇菌絲體質(zhì)量濃度以及腺苷含量。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同碳源對發(fā)酵的影響

由表2可以看出：4種培養(yǎng)基的碳源不同，實驗菌種均能成長，且隨著碳源濃度的增加，菌絲體干重明顯增加，其中膨化玉米粉為最優(yōu)，蔗糖次之；腺苷含量也呈現(xiàn)明顯增加趨勢，其中蔗糖最優(yōu)，膨化玉米粉次之，可溶性淀粉為30g／L時腺苷含量略有下降。膨化玉米粉中的粗蛋白含量一般在10%左右，總糖含量一般在80%以上，是一種理想的碳源培養(yǎng)基原料?？梢?，金針菇對不同碳源的利用程度和能力依次為膨化玉米粉＞蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉。

表2 不同碳源對發(fā)酵效果的影響Table 2 Effects of different carbon sources on fermentation efficiency

2．2 不同氮源對發(fā)酵的影響

從表3中可以看出：金針菇菌絲體在選取的幾種不同氮源中都能生長，從最終的菌絲體干重和腺苷含量可以看出，種類不同則區(qū)別相對比較顯著。其中，玉米漿干粉和大豆蛋白胨作為可溶性氮源優(yōu)于不溶性氮源中的高溫黃豆粉和花生餅粉；不溶性氮源中的低溫黃豆粉效果最為明顯，中溫黃豆粉次之；高溫黃豆粉在所有選用的氮源中效果最差。金針菇菌絲體對不同氮源的利用能力依次為低溫黃豆粉＞玉米漿干粉＞大豆蛋白胨＞中溫黃豆粉＞花生餅粉＞高溫黃豆粉。

表3 不同氮源對發(fā)酵效果的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on fermentation efficiency

2．3 正交試驗結(jié)果

從表4中可以看出：以腺苷含量為試驗指標，培養(yǎng)基中各因素影響的主次順序為A（低溫黃豆粉）＞C（玉米漿干粉）＞D（膨化玉米粉）＞B（蔗糖），最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A2B2C2D3，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，蔗糖30g／L，低溫黃豆粉20g／L。而根據(jù)菌絲體干重指標來看，培養(yǎng)基中各因素的主次順序為A（低溫黃豆粉）＞D（膨化玉米粉）＞C（玉米漿干粉）＞B（蔗糖），最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A3B2C2D3。即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L，蔗糖30g／L。根據(jù)發(fā)酵時長和原料成本來看，A（低溫黃豆粉）含量高，需要更長的發(fā)酵時間和更高的成本，因此選擇最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A2B2C2D3進行后續(xù)的200L發(fā)酵試驗。

表4 培養(yǎng)基濃度配比的正交試驗結(jié)果1）Table 4 Orthogonal test results of medium concentration ratio

2．4 發(fā)酵結(jié)果

200L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中的溶氧和pH變化曲線見圖1；氨態(tài)氮和菌絲體干重變化曲線見圖2；還原糖含量和腺苷含量的變化曲線見圖3。

圖1 溶氧和pH隨時間的變化曲線Fig．1 The curve of dissolvedoxygen and pH

圖2 氨態(tài)氮和菌絲體質(zhì)量濃度隨時間的變化曲線Fig．2 The curve of time and ammonia nitrogenand dry weight of mycelia

圖3 還原糖質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分數(shù)隨時間的變化曲線Fig．3 The curve of time and reducing sugar and adenosine content

由圖1～3可知：在整個發(fā)酵過程中pH和溶氧都呈下降趨勢，還原糖質(zhì)量濃度先上升后下降，這是因為在菌絲體生長前期，快速產(chǎn)生糖化酶，將培養(yǎng)基中的碳源由原來的多糖分解成還原糖單體，但是菌體分解多糖的能力大于消耗碳源的能力，因此前期還原糖含量呈上升趨勢，但是隨著菌絲體的快速生長繁殖，菌絲體濃度增加，碳源消耗能力迅速增長，因此還原糖含量逐漸下降。在發(fā)酵過程中，氨態(tài)氮的含量波動范圍不大，先下降然后上升，這是由于發(fā)酵后期部分菌絲球老化，蛋白質(zhì)分解自溶釋放出氨態(tài)氮類物質(zhì)。菌絲體質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分數(shù)都逐漸上升至一定程度后開始下降。當溶氧下降到一定程度，通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量將溶氧維持在一定范圍內(nèi)，當還原糖基本耗完后溶氧開始回升。在全部的過程中，pH持續(xù)降低，這是由菌絲體生長產(chǎn)生有機酸類物質(zhì)所致［6］。發(fā)酵后期還原糖耗盡，菌絲體老化并釋放氨態(tài)氮類物質(zhì)，pH開始回升。當還原糖低于5g／L時，腺苷質(zhì)量分數(shù)和菌絲體質(zhì)量濃度都會下降。當還原糖耗盡后并長期缺乏時，菌絲體會將腺苷作為營養(yǎng)物，從而導(dǎo)致腺苷含量大幅下降。因此在發(fā)酵過程中可以通過觀察溶氧和pH的變化，配合還原糖的檢測來決定發(fā)酵的終點，當還原糖接近5g／L時即可結(jié)束發(fā)酵［7］。

選用篩選后的培養(yǎng)基在200L發(fā)酵罐重復(fù)5次發(fā)酵試驗，接種量為15%，發(fā)酵周期為45～56h。

表5 200L發(fā)酵罐發(fā)酵效果表Table 5 The fermentation effect of 200Lfermentor

從表5的5組試驗可以看出：放罐時的還原糖低于5g／L的第1和2組，其腺苷質(zhì)量分數(shù)明顯少于放罐時還原糖高于5g／L的第3～5組。獲得的金針菇菌粉質(zhì)量濃度平均值為24．0g／L，均大于20g／L，符合成品檢測標準。菌粉中的腺苷質(zhì)量分數(shù)平均值為394．6μg／g，均大于100μg／g，符合成品檢測標準。菌絲體質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分數(shù)分別較原有工藝中的提高了33．0%和97．0%。改進后的發(fā)酵工藝效果顯著。

3 結(jié) 論

金針菇屬于木腐生菌，能夠供它生長的營養(yǎng)物質(zhì)種類繁多?，F(xiàn)有報道的發(fā)酵工藝中菌絲體質(zhì)量濃度普遍在16～20g／L［4－5］，部分質(zhì)量濃度較高但是沒有通過中試以上驗證，關(guān)于腺苷質(zhì)量分數(shù)的文獻報道較少。本研究以菌體質(zhì)量濃度和腺苷為考察因素，采用單因素和正交試驗確定金針菇菌絲生長的最佳培養(yǎng)基組成為低溫黃豆粉20g／L，蔗糖30g／L，玉米漿干粉10g／L，膨化玉米粉25g／L，KH2PO43g／L和MgSO4·7H2O 1．5g／L。金針菇菌絲球通過該配方進行培育后直徑較大且規(guī)整，具有透亮的過濾清液，金針菇香味顯著，烘干的菌粉成品中腺苷質(zhì)量分數(shù)和菌絲體質(zhì)量濃度都符合企業(yè)生產(chǎn)要求，且較原有工藝有較大提高，效果顯著。