嚴(yán)燕兵，肖延銘，華 超，金 力，袁 圍

（1．長(zhǎng)興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長(zhǎng)興313100；2．浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州310014）

金針菇菌絲體（Mycelium of Flammulina velutipes）是金菌靈膠囊的主要原料。長(zhǎng)興制藥股份有限公司最早開(kāi)發(fā)制成的金菌靈膠囊具有扶正固本和調(diào)補(bǔ)氣血的功能，主要用于治療中醫(yī)氣血兩虛癥和被西醫(yī)評(píng)判為肺癌癥的患者。目前，受生產(chǎn)金針菇菌絲體的發(fā)酵原料大幅漲價(jià)的影響，發(fā)酵后的菌粉售價(jià)已由2010年的100元／kg上升至2017年的200元／kg。利用現(xiàn)有的發(fā)酵工藝，每升培養(yǎng)液獲得的金針菇菌絲體干重為16～20g，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150～200μg／g，這兩項(xiàng)指標(biāo)均處于較低水平，進(jìn)一步增加了發(fā)酵成本［1］。因此，開(kāi)展金針菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝研究，降低發(fā)酵成本，提高金針菇菌絲體的發(fā)酵產(chǎn)能，已經(jīng)成為企業(yè)的迫切任務(wù)。工業(yè)化金針菇菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，多采用發(fā)酵工業(yè)用粗料培養(yǎng)基，盡管采用這種方法可以獲得較高的菌絲體得率，但是和水溶性碳源、氮源比較，天然來(lái)源的粗料培養(yǎng)基存在水溶性差、成分復(fù)雜的弊端［3－4］。針對(duì)以上情況，筆者研究了不同的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基組成對(duì)金針菇菌絲體生物量的影響，為金針菇液體生產(chǎn)發(fā)酵成本的降低和菌絲體菌粉質(zhì)量穩(wěn)定性的提升奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 菌 種

金針菇菌種：由長(zhǎng)興制藥股份有限公司研發(fā)中心菌種庫(kù)保藏。

1．1．2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA）：購(gòu)于BD公司（美國(guó)BD公司，Becton，Dickinson and Company）的PDA 粉末，稱(chēng)取39g溶于1L水中，pH自然。

碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1．5g／L，大豆蛋白胨20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO43g／L。

氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1．5g／L，膨化玉米粉20g／L，KH2PO43g／L，蔗糖20g／L。

碳源篩選：蔗糖、葡萄糖、膨化玉米粉和可溶性淀粉。

氮源篩選：低溫黃豆粉、中溫黃豆粉、高溫黃豆粉、大豆蛋白胨、花生餅粉和玉米漿干粉。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 斜面菌種制備

將取自金針菇冷凍甘油管的菌種在無(wú)菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基PDA上，恒溫25℃培養(yǎng)7～10d，挑選菌落生長(zhǎng)狀況良好、無(wú)污染的斜面菌種，冷藏保存在4℃冰箱，備用。

1．2．2 最佳碳源、氮源的篩選

在500mL三角瓶中加入碳源10g／L，氮源10g／L和玉米漿干粉10g／L，KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至100mL，混合充分后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至7．2～7．3，121℃滅菌30min，降溫冷卻，在無(wú)菌條件下將斜面培養(yǎng)基中的菌種用接種鏟鏟出一塊1cm2左右的菌種塊，切碎，平均接種于各搖瓶，25℃，150r／min搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1周，觀測(cè)金針菇菌絲生長(zhǎng)情況，過(guò)濾出菌絲體，烘干測(cè)干重，采用液相色譜檢測(cè)菌絲中腺苷含量。

1．2．3 正交試驗(yàn)

以各單因素試驗(yàn)最佳條件為基礎(chǔ)，選擇低溫黃豆粉、玉米漿干粉、膨化玉米粉和蔗糖4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平的培養(yǎng)基濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)表完成，主要參考指標(biāo)為腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌絲體質(zhì)量濃度，確定金針菇菌絲體發(fā)酵最適合的培養(yǎng)基濃度的組合。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)水平和因素如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment g／L

1．2．4 成品指標(biāo)

1）性狀：呈淺黃色至棕褐色細(xì)粉，氣微香，味淡。

2）水分指標(biāo)：減失重量不得超過(guò)5．0%。

測(cè)定方法：取本品2．0g，精密稱(chēng)定，105℃干燥至恒重。

3）含量指標(biāo)：本品腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C10H13N5O4）不小于100μg／g。

測(cè)定方法：高效液相色譜法（中國(guó)藥典2000年版一部附錄Ⅵ D）［11］。

1．2．5 200L發(fā)酵驗(yàn)證

1）種子搖瓶制備

在1 000mL三角瓶中加入篩選后的碳源和氮源，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L，蔗糖30g／L，以及 KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至200mL，混合充分后，用氨水調(diào)pH 至7．2～7．3，121℃滅菌30min。降溫冷卻，在無(wú)菌條件下將斜面培養(yǎng)基中的菌種用接種鏟鏟出一塊1cm2左右的菌種塊，切碎，平均接種于各搖瓶，25℃，150r／min搖床培養(yǎng)1周，對(duì)菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀測(cè)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的作為種子搖瓶，備用。

2）發(fā)酵驗(yàn)證

在200L發(fā)酵罐中加入篩選后的碳源和氮源，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L和蔗糖30g／L，以及 KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 1．5g／L，加水至120L，混合充分，用氨水調(diào)pH值至7．2～7．3，121℃滅菌30min。降溫冷卻，將種子搖瓶的菌種接種至發(fā)酵罐，接種量為15%，轉(zhuǎn)速200r／min，25℃培養(yǎng)，通氣量為1．0m3／（m3·min）。每隔12h取樣檢測(cè)還原糖含量和氨態(tài)氮含量，還原糖質(zhì)量濃度小于10g／L時(shí)放罐，過(guò)濾發(fā)酵液，收集菌絲體，烘干，打成粉末，檢測(cè)金針菇菌絲體質(zhì)量濃度以及腺苷含量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響

由表2可以看出：4種培養(yǎng)基的碳源不同，實(shí)驗(yàn)菌種均能成長(zhǎng)，且隨著碳源濃度的增加，菌絲體干重明顯增加，其中膨化玉米粉為最優(yōu)，蔗糖次之；腺苷含量也呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，其中蔗糖最優(yōu)，膨化玉米粉次之，可溶性淀粉為30g／L時(shí)腺苷含量略有下降。膨化玉米粉中的粗蛋白含量一般在10%左右，總糖含量一般在80%以上，是一種理想的碳源培養(yǎng)基原料。可見(jiàn)，金針菇對(duì)不同碳源的利用程度和能力依次為膨化玉米粉＞蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉。

表2 不同碳源對(duì)發(fā)酵效果的影響Table 2 Effects of different carbon sources on fermentation efficiency

2．2 不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響

從表3中可以看出：金針菇菌絲體在選取的幾種不同氮源中都能生長(zhǎng)，從最終的菌絲體干重和腺苷含量可以看出，種類(lèi)不同則區(qū)別相對(duì)比較顯著。其中，玉米漿干粉和大豆蛋白胨作為可溶性氮源優(yōu)于不溶性氮源中的高溫黃豆粉和花生餅粉；不溶性氮源中的低溫黃豆粉效果最為明顯，中溫黃豆粉次之；高溫黃豆粉在所有選用的氮源中效果最差。金針菇菌絲體對(duì)不同氮源的利用能力依次為低溫黃豆粉＞玉米漿干粉＞大豆蛋白胨＞中溫黃豆粉＞花生餅粉＞高溫黃豆粉。

表3 不同氮源對(duì)發(fā)酵效果的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on fermentation efficiency

2．3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4中可以看出：以腺苷含量為試驗(yàn)指標(biāo)，培養(yǎng)基中各因素影響的主次順序?yàn)锳（低溫黃豆粉）＞C（玉米漿干粉）＞D（膨化玉米粉）＞B（蔗糖），最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A2B2C2D3，即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，蔗糖30g／L，低溫黃豆粉20g／L。而根據(jù)菌絲體干重指標(biāo)來(lái)看，培養(yǎng)基中各因素的主次順序?yàn)锳（低溫黃豆粉）＞D（膨化玉米粉）＞C（玉米漿干粉）＞B（蔗糖），最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A3B2C2D3。即膨化玉米粉25g／L，玉米漿干粉10g／L，低溫黃豆粉25g／L，蔗糖30g／L。根據(jù)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)和原料成本來(lái)看，A（低溫黃豆粉）含量高，需要更長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間和更高的成本，因此選擇最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為A2B2C2D3進(jìn)行后續(xù)的200L發(fā)酵試驗(yàn)。

表4 培養(yǎng)基濃度配比的正交試驗(yàn)結(jié)果1）Table 4 Orthogonal test results of medium concentration ratio

2．4 發(fā)酵結(jié)果

200L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中的溶氧和pH變化曲線見(jiàn)圖1；氨態(tài)氮和菌絲體干重變化曲線見(jiàn)圖2；還原糖含量和腺苷含量的變化曲線見(jiàn)圖3。

圖1 溶氧和pH隨時(shí)間的變化曲線Fig．1 The curve of dissolvedoxygen and pH

圖2 氨態(tài)氮和菌絲體質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化曲線Fig．2 The curve of time and ammonia nitrogenand dry weight of mycelia

圖3 還原糖質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化曲線Fig．3 The curve of time and reducing sugar and adenosine content

由圖1～3可知：在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH和溶氧都呈下降趨勢(shì)，還原糖質(zhì)量濃度先上升后下降，這是因?yàn)樵诰z體生長(zhǎng)前期，快速產(chǎn)生糖化酶，將培養(yǎng)基中的碳源由原來(lái)的多糖分解成還原糖單體，但是菌體分解多糖的能力大于消耗碳源的能力，因此前期還原糖含量呈上升趨勢(shì)，但是隨著菌絲體的快速生長(zhǎng)繁殖，菌絲體濃度增加，碳源消耗能力迅速增長(zhǎng)，因此還原糖含量逐漸下降。在發(fā)酵過(guò)程中，氨態(tài)氮的含量波動(dòng)范圍不大，先下降然后上升，這是由于發(fā)酵后期部分菌絲球老化，蛋白質(zhì)分解自溶釋放出氨態(tài)氮類(lèi)物質(zhì)。菌絲體質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)都逐漸上升至一定程度后開(kāi)始下降。當(dāng)溶氧下降到一定程度，通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量將溶氧維持在一定范圍內(nèi)，當(dāng)還原糖基本耗完后溶氧開(kāi)始回升。在全部的過(guò)程中，pH持續(xù)降低，這是由菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)生有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)所致［6］。發(fā)酵后期還原糖耗盡，菌絲體老化并釋放氨態(tài)氮類(lèi)物質(zhì)，pH開(kāi)始回升。當(dāng)還原糖低于5g／L時(shí)，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌絲體質(zhì)量濃度都會(huì)下降。當(dāng)還原糖耗盡后并長(zhǎng)期缺乏時(shí)，菌絲體會(huì)將腺苷作為營(yíng)養(yǎng)物，從而導(dǎo)致腺苷含量大幅下降。因此在發(fā)酵過(guò)程中可以通過(guò)觀察溶氧和pH的變化，配合還原糖的檢測(cè)來(lái)決定發(fā)酵的終點(diǎn)，當(dāng)還原糖接近5g／L時(shí)即可結(jié)束發(fā)酵［7］。

選用篩選后的培養(yǎng)基在200L發(fā)酵罐重復(fù)5次發(fā)酵試驗(yàn)，接種量為15%，發(fā)酵周期為45～56h。

表5 200L發(fā)酵罐發(fā)酵效果表Table 5 The fermentation effect of 200Lfermentor

從表5的5組試驗(yàn)可以看出：放罐時(shí)的還原糖低于5g／L的第1和2組，其腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯少于放罐時(shí)還原糖高于5g／L的第3～5組。獲得的金針菇菌粉質(zhì)量濃度平均值為24．0g／L，均大于20g／L，符合成品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。菌粉中的腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為394．6μg／g，均大于100μg／g，符合成品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。菌絲體質(zhì)量濃度和腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較原有工藝中的提高了33．0%和97．0%。改進(jìn)后的發(fā)酵工藝效果顯著。

3 結(jié) 論

金針菇屬于木腐生菌，能夠供它生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)繁多。現(xiàn)有報(bào)道的發(fā)酵工藝中菌絲體質(zhì)量濃度普遍在16～20g／L［4－5］，部分質(zhì)量濃度較高但是沒(méi)有通過(guò)中試以上驗(yàn)證，關(guān)于腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以菌體質(zhì)量濃度和腺苷為考察因素，采用單因素和正交試驗(yàn)確定金針菇菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基組成為低溫黃豆粉20g／L，蔗糖30g／L，玉米漿干粉10g／L，膨化玉米粉25g／L，KH2PO43g／L和MgSO4·7H2O 1．5g／L。金針菇菌絲球通過(guò)該配方進(jìn)行培育后直徑較大且規(guī)整，具有透亮的過(guò)濾清液，金針菇香味顯著，烘干的菌粉成品中腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌絲體質(zhì)量濃度都符合企業(yè)生產(chǎn)要求，且較原有工藝有較大提高，效果顯著。