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(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015; 2.廣東中食營科生物科技有限公司,廣東東莞 523122)

玉米低聚肽是由玉米經(jīng)酶解后得到的具有生物活性的小分子,由于具有豐富的生理功能而受到廣泛關(guān)注。劉文穎等[1]研究了玉米低聚肽對(duì)于DPPH、OH等自由基的清除能力,發(fā)現(xiàn)玉米低聚肽具有一定的抗氧化活性。Yamaguchi等[2]發(fā)現(xiàn)玉米肽因富含疏水氨基酸，而表現(xiàn)出促進(jìn)乙醇在人體中新陳代謝的作用。Huang等[3]報(bào)道稱，玉米肽可通過抑制一種與血壓調(diào)節(jié)相關(guān)的酶—血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性，從而起到降血壓的作用。劉雪姣[4]通過細(xì)胞中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)等活性的變化，證明玉米低聚肽可以從促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞增殖與對(duì)抗細(xì)胞損傷兩個(gè)方面保護(hù)肝干細(xì)胞。

微量元素是人體必須的營養(yǎng)物質(zhì),但以無機(jī)鹽形式存在的微量元素在生物機(jī)體內(nèi)的利用率不超過20%。而小肽由于其肽鏈短等分子結(jié)構(gòu)性質(zhì),在體內(nèi)具有吸收利用率高、排泄率低、消化穩(wěn)定性好、毒性低等特點(diǎn)[5]。小肽還可與Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Ca2+等金屬離子螯合[6-9],這些小肽螯合物兼具了小肽和微量元素的易吸收利用、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多重功效[8]。硒也是人體內(nèi)必須的一種微量元素,大量的研究已表明，缺硒會(huì)導(dǎo)致人免疫力低下、克山病等多種健康問題[11-12]。最近Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，缺硒可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡,從而引起大骨節(jié)病。Vaz等[14]研究發(fā)現(xiàn),阿茨海默癥的誘發(fā)也與體內(nèi)硒含量水平降低相關(guān)。目前對(duì)這種肽-硒螯合的物質(zhì)研究尚不完善,因此制備新型肽-硒螯合物并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行探討，對(duì)肽類產(chǎn)品的應(yīng)用和硒元素的人體攝入方式提供了理論基礎(chǔ)。本文以玉米低聚肽和亞硒酸鈉為原料，制備玉米低聚肽硒螯合物,以分子量分布和螯合態(tài)硒含量為指標(biāo),探究玉米低聚肽硒螯合物對(duì)溫度、pH和消化方式的穩(wěn)定性,以期為市場(chǎng)上提供一種新型補(bǔ)硒產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

玉米低聚肽 總蛋白質(zhì)(以干基計(jì))含量80%,中食海氏生物科技有限公司;五水亞硒酸鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠;3′3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB 4HCl)(試劑級(jí))、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(生物技術(shù)級(jí)) Biotopped公司;氫溴酸 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;鹽酸羥胺、高氯酸、硝酸、鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇、甲苯、三氯乙酸 分析純,北京化工廠;胃蛋白酶、胰蛋白酶 酶活20萬～150萬U/g,南寧龐博生物有限公司;三氟乙酸 分析純,Alfa Aesar 公司;乙腈 色譜純,Fisher公司;透析袋 截留分子質(zhì)量8000～14000 u,Biotopped公司;去離子水 實(shí)驗(yàn)室自制。

EL20 pH計(jì) Mettler Toledo;KQ-250E超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司;Spectra Mr酶標(biāo)儀 Dynex Technologies;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 北京陸?？萍加邢薰?萬用電爐 北京科偉永興儀器有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀 日本島津公司;F30200150凱氏定氮儀 Velp Scientifica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米低聚肽硒螯合物的制備 參照王小林等[15]的方法并稍做改動(dòng)。取8 g玉米低聚肽溶于100 mL去離子水中,制備成8%的玉米低聚肽水溶液。加入16 g五水亞硒酸鈉,于超聲波振蕩器中混勻。調(diào)節(jié)pH為6.0,在50 ℃條件下水浴螯合40 min。趁熱迅速倒入4倍體積的95%乙醇,封口后25 ℃靜置過夜。將上清液倒出,于35 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干,得到玉米低聚肽硒螯合物樣品。

1.2.2 玉米低聚肽硒螯合物硒含量的測(cè)定 配制1 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,精確量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,以去離子水加至10 mL。加10 mL混酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)電加熱爐上消解至澄清淡黃色狀態(tài)。添加5 mL 1∶1鹽酸(濃鹽酸:蒸餾水),電加熱爐上繼續(xù)消解至1 mL。后加入10 mL 5%EDTA-2Na溶液,10 mL 10%鹽酸羥胺溶液,混合后以1∶1鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3之間。然后加入5‰ DAB溶液,遮光靜置30 min。以40% NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.8～7.0之間,以10 mL甲苯萃取反應(yīng)產(chǎn)物10 min。取有機(jī)層溶液,在420 nm處檢測(cè)吸光值。以硒濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取樣品重復(fù)上述步驟得到樣品的吸光值。根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到硒含量。

1.2.3 玉米低聚肽硒螯合物得率和螯合率的計(jì)算

式(1)

其中,m1為螯合物中硒元素的質(zhì)量(g),m2為加入螯合體系硒元素的質(zhì)量。

式(2)

其中,m3為螯合產(chǎn)物質(zhì)量(g),m4為加入螯合體系總物質(zhì)的質(zhì)量(g)。

1.2.4 玉米低聚肽硒螯合物的理化性質(zhì)的測(cè)定 參照國標(biāo)法GB 5009.3-2010[16],測(cè)定玉米低聚肽硒螯合物的水分含量。參照國標(biāo)法GB 5009.5-2010[17]測(cè)定玉米低聚肽硒螯合物的總氮(蛋白質(zhì))含量。參照國標(biāo)法GB 22729-2008[18],測(cè)定玉米低聚肽硒螯合物中酸溶蛋白的含量。采用文獻(xiàn)[19]所述的高效凝膠過濾色譜法測(cè)定樣品分子量及分布情況。

1.2.5 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將玉米低聚肽硒螯合物樣品溶于去離子水,配制成螯合物濃度為3 mg/mL 的溶液,取20 mL溶液置于50 mL離心管中,分別在25、40、60、80、100 ℃下恒溫水浴2 h,其中25 ℃為室溫對(duì)照組。冷卻至室溫,檢測(cè)其分子量分布。然后取樣3 mL置于透析袋,經(jīng)蒸餾水透析60 h后檢測(cè)硒含量。

1.2.6 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將玉米低聚肽硒螯合物樣品溶于去離子水,配制成螯合物濃度為3 mg/mL 的溶液,取20 mL溶液置于離心管中,分別用1 mol/L HCl和10% NaOH 調(diào)節(jié)各管pH至2、4、6、8,10、12,于25 ℃恒溫水浴鍋中放置2 h,同時(shí)設(shè)置一未處理的對(duì)照組(玉米低聚肽硒螯合物的水溶液的pH介于6.5～6.8之間),冷卻至室溫,檢測(cè)其分子量分布,然后取樣3 mL置于透析袋,經(jīng)蒸餾水透析60 h后檢測(cè)硒含量。

1.2.7 體外模擬胃腸消化道實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn) 將玉米低聚肽硒螯合物樣品溶于去離子水,配制螯合物濃度為3 mg/mL的溶液,取30 mL溶液置于離心管中。以1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH=1.5,在37 ℃恒溫水浴中孵育20 min。后添加6‰(物料比)的胃蛋白酶,充分混勻,其余操作同1.2.7.1。

1.2.7.2 胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn) 將玉米低聚肽硒螯合物樣品溶于去離子水,配制螯合物濃度為3 mg/mL 的溶液,取30 mL溶液置于離心管中。以10% NaOH調(diào)節(jié)溶液pH=7.5,在37 ℃恒溫水浴中孵育20 min。添加2‰(物料比)的胰蛋白酶,充分混勻,迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應(yīng),作為消化前對(duì)照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h,然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應(yīng)。室溫下冷卻后檢測(cè)其分子量分布,然后取樣3 mL置于透析袋,經(jīng)蒸餾水透析60 h后檢測(cè)硒含量。

1.2.7.3 先胃蛋白酶再胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn) 按照1.2.7.1的方法進(jìn)行取樣和胃蛋白酶消化后,用10% NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5,在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育20 min,加入2‰(物料比)胰蛋白酶,充分混勻,置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h,然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應(yīng)。室溫下冷卻后檢測(cè)其分子量分布,然后取樣3 mL置于透析袋,經(jīng)透析袋透析60 h后檢測(cè)硒含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS v20軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析,若t檢驗(yàn)p<0.05,則證明數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2所述方法,繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0075x+0.0143,R2=0.9987。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Selenium standard curve

2.2 玉米低聚肽硒螯合物的產(chǎn)物指標(biāo)和理化性質(zhì)

對(duì)螯合反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行測(cè)算,得到玉米低聚肽硒螯合物的產(chǎn)物螯合率為54.25%±0.24%,得率為53.02%±0.17%,相對(duì)于類似工藝制備的肽硒螯合物[20],玉米低聚肽硒螯合物具有更高的產(chǎn)物螯合率和得率。對(duì)樣品進(jìn)行基礎(chǔ)理化測(cè)試,得到樣品水分含量為7.46%±0.07%,酸溶蛋白含量為16.38%±0.03%,總氮(粗蛋白)含量為21.17%±0.35%,酸溶蛋白占粗蛋白的比例高達(dá)77.38%。

經(jīng)檢測(cè),玉米低聚肽硒螯合物分子量分布如表1所示。有超過85%的分子量分布在1000 u以下,含量最高的是小于140 u的小肽,約占50%,據(jù)報(bào)道,分子量低于1000 u組分可被腸道完整地吸收,營養(yǎng)價(jià)值和生理功能都比游離氨基酸更高[21-23]。

表1 玉米低聚肽硒螯合物分子量分布(%)Table 1 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide(%)

2.3 玉米低聚肽硒螯合物的熱穩(wěn)定性

玉米低聚肽硒螯合物在不同溫度下的分子量分布情況如表2所示。結(jié)果顯示,隨著水浴溫度的升高,分子量分布在1000 u之下的部分所占比例都有所升高,但各溫度組之間的變化比例接近,都在3%～7%之間。對(duì)透析后的樣品硒含量進(jìn)行測(cè)定,以25 ℃為對(duì)照組,對(duì)其余各組相對(duì)對(duì)照組硒含量的比例進(jìn)行比較。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí),硒含量變化不顯著(p>0.05),當(dāng)水浴溫度處于60～100 ℃區(qū)間內(nèi)時(shí),硒含量相對(duì)比例顯著降低(p<0.05),但在100 ℃時(shí),螯合態(tài)的硒含量仍在70%以上,這說明玉米低聚肽硒螯合物對(duì)于溫度有很高的穩(wěn)定性。

表2 不同溫度下玉米低聚肽硒螯合物分子量分布(%)Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different temperature(%)

圖2 不同溫度下玉米低聚肽硒螯合物中硒含量Fig.2 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different temperature注:*表示不同組與對(duì)照組相比具有顯著差異(p<0.05),圖3～圖4同。

2.4 玉米低聚肽硒螯合物的酸堿穩(wěn)定性

玉米低聚肽硒螯合物在不同酸堿條件下的分子量分布情況如表3所示。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在偏酸性環(huán)境下(pH=2、4),分子量超過1000 u部分所占的比例變化在13%～16%之間,而在接近中性和弱堿性環(huán)境下(pH=6、8),比例變化范圍低于2%,在強(qiáng)堿性環(huán)境下(pH=10、12),比例變化不超過7%。說明酸性環(huán)境更利于肽鏈的斷裂,使分子分解成更多的小肽。對(duì)透析后的樣品硒含量進(jìn)行測(cè)定,以未經(jīng)處理的玉米低聚肽硒螯合物水溶液為對(duì)照組,對(duì)其余調(diào)節(jié)pH后的各組相對(duì)于對(duì)照組的硒含量的比例進(jìn)行比較,結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)硒含量在pH 2、4和12的酸性和強(qiáng)堿環(huán)境下顯著降低(p<0.05),但最低硒含量仍在75%以上,不同的pH環(huán)境會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,推測(cè)可能是酸性環(huán)境肽鏈斷裂間接導(dǎo)致螯合態(tài)的硒從配體上脫落,而堿性環(huán)境對(duì)肽鏈的破壞能力就小得多[24-25]。酸性或堿性環(huán)境雖然使一部分肽鏈發(fā)生斷裂,但螯合態(tài)的硒含量仍保留3/4以上的比例,玉米低聚肽硒螯合物也具有酸堿穩(wěn)定性。

表3 不同pH下玉米低聚肽硒螯合物的分子量分布(%)Table 3 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different pH(%)

圖3 不同pH下玉米低聚肽硒螯合物硒含量Fig.3 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different pH

2.5 玉米低聚肽硒螯合物的消化穩(wěn)定性

玉米低聚肽硒螯合物經(jīng)過不同的消化方式處理后分子量變化情況如表4所示。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,經(jīng)過胃蛋白酶的消化,玉米低聚肽硒螯合物分子量在1000 u以下的部分所占的比例約增加5%;經(jīng)過胰蛋白酶消化后,該分子量區(qū)間所占比例約增加7%;經(jīng)過兩種酶消化后,該比例變化約增加8%。以未經(jīng)胃蛋白酶或胰蛋白酶消化的玉米低聚肽硒螯合物水溶液為對(duì)照組,對(duì)三種消化方式處理后的各組與對(duì)照組的硒含量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過兩種酶分別和復(fù)合消化,硒含量顯著降低(p<0.05)。但螯合態(tài)的硒含量最低仍能保持在70%以上,證明玉米低聚肽硒螯合物具有一定的消化穩(wěn)定性。

表4 不同消化方式下玉米低聚肽硒螯合物的分子量分布(%)Table 4 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different digestion mode

圖4 不同消化方式下玉米低聚肽硒螯合物硒含量Fig.4 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different digestion mode

3 結(jié)論

本研究以玉米低聚肽和亞硒酸鈉為原料,制備出玉米低聚肽硒螯合物,并對(duì)其基礎(chǔ)理化性質(zhì)和對(duì)熱、酸堿以及消化方式的穩(wěn)定性做了探究。結(jié)果表明,玉米低聚肽硒螯合物的螯合率為54.25%±0.24%,得率為53.02%±0.17%,水分含量為7.46%±0.07%,酸溶蛋白含量為16.38%±0.03%,總氮(粗蛋白)含量為21.17%±0.35%,酸溶蛋白占粗蛋白的比例為77.38%,利于人體腸道吸收。

玉米低聚肽硒螯合物對(duì)于熱處理具有良好的穩(wěn)定性,不同溫度環(huán)境下,螯合物的分子量在1000 u之下的部分所占比例變化都在3%～7%之間,螯合態(tài)的硒含量最低仍在70%以上;對(duì)不同pH環(huán)境也具有良好的穩(wěn)定性,在酸性環(huán)境下,肽鏈更易斷裂,螯合態(tài)硒含量變化最大,但最低硒含量仍在75%以上;對(duì)于不同消化方式也具有一定的穩(wěn)定性,在經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶和兩種酶的消化后,分子量低于1000 u的部分所占的比例分別增加5%、7%和8%,螯合態(tài)的硒雖然顯著降低(p<0.05),但最低硒含量仍在70%以上。由于人體小腸對(duì)二肽、三肽的直接吸收作用,螯合態(tài)的硒可隨之被機(jī)體直接利用。對(duì)于需要補(bǔ)充硒元素的人群,玉米低聚肽硒螯合物可作為一種新型的補(bǔ)硒制劑,開發(fā)成功能性產(chǎn)品以推廣。