戴世金，周紫薇，張子莎，雷茗淇，趙由才

(同濟大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

1 引 言

餐廚垃圾是城市固體廢棄物中的重要組成部分，其含水率、有機物含量均較高，富含脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等可生物降解的有機物質(zhì)及大量的鹽分，已被認為是發(fā)達國家與發(fā)展中國家經(jīng)濟、社會、環(huán)境領(lǐng)域的共同問題[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國有660個城市，各類餐館有350多萬家，餐廚廢棄物日均產(chǎn)量超過50噸的城市有512個，餐飲企業(yè)每年產(chǎn)生的餐廚廢棄物約4 000萬噸，可利用餐廚廢棄物總量每年有3 000萬噸[2]。

目前來看，厭氧發(fā)酵不僅可以通過微生物的作用將餐廚垃圾降解，還可以實現(xiàn)部分資源 化與能源化，已經(jīng)成為我國規(guī)?；幚淼闹髁骷夹g(shù)[3]。然而，在發(fā)酵過程中，大量剩余的厭氧發(fā)酵液(沼液)如何處理就成為建設(shè)單位迫切需要解決的問題。發(fā)酵液產(chǎn)生量大，若全部就地消納利用存在難度；若采用遠距離輸送，則建設(shè)單位難以承受它的高能耗和高成本；若任意排放，不進行即時處理，則又可能給環(huán)境帶來二次污染的風(fēng)險[4]。

餐廚垃圾厭氧發(fā)酵液是一種難處理的高濃度有機廢水，化學(xué)組成以溶解性蛋白質(zhì)、糖類、動物脂肪、有機酸和無機鹽為主[2, 5]。餐廚垃圾發(fā)酵液中有機質(zhì)、氮、磷含量高，重金屬含量低，有毒有害成分少，是植物生長的良好肥料和土壤的理想改良劑。施用發(fā)酵液可改善土壤環(huán)境，有利于調(diào)節(jié)土壤pH值，增加土壤中氮、磷、鉀和有機質(zhì)含量[6]。同時，發(fā)酵液中含有的氨、腐殖酸、維生素和植物激素類對土壤中的病原菌有明顯的生長抑制作用[7]。根據(jù)我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的大量有機酸不僅可作為微生物碳源[8]，也可以用于重金屬土壤修復(fù)中的淋洗劑[9]。然而，由于餐廚垃圾成分復(fù)雜，在淋洗過程中，土壤中的多種有機組分和微生物與土壤相互作用，對土壤產(chǎn)生一定的影響。本文針對餐廚垃圾發(fā)酵液淋洗土壤前后，研究土壤的理化性質(zhì)變化和微生物群落變化。

2 材料與方法

2.1 發(fā)酵液淋洗的土壤制備

餐廚垃圾發(fā)酵液來自于餐廚垃圾發(fā)酵9 d后的穩(wěn)定發(fā)酵液，淋洗采用質(zhì)量比為10∶1的淋洗液和土壤比[9]，采用翻轉(zhuǎn)振蕩的方法持續(xù)淋洗一定時間，設(shè)立空白組和對照組。淋洗土壤樣品分為六組實驗：0(原始土壤)、L-1(發(fā)酵液淋洗12 h)、L-2(發(fā)酵液淋洗24 h)、W-1(水淋洗12 h)、W-2(水淋洗24 h)、UV(發(fā)酵液淋洗12 h同時紫外光滅菌照射)。每種土樣取部分于50 mL的離心管中，置于-20℃冰箱中以備DNA提取和土壤理化性質(zhì)檢測。

2.2 土壤性質(zhì)和肥力的測定

測定土壤淋洗前后的pH、有機質(zhì)、陽離子交換量(CEC)、有效氮、總氮、總磷、有效磷、可交換鉀/鈣/鈉/鎂等性質(zhì)。土壤pH的測定參考ISO10390∶2005標準方法，干燥后以1∶5的比例溶于水后，采用pH計(PHSJ-4F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定上清液的pH值。土壤有機質(zhì)、CEC和可交換離子含量參照標準土壤分析方法。

2.3 微生物群落測試方法

土壤微生物群落的測試由美吉生物完成(上海，中國)，其主要的工作流程如下。

2.3.1 基因組DNA抽提

用Mobio PowerSoilRRDNA Isolation Kit提取土壤樣品中微生物總基因組DNA，并利用Mobio PowerCleanRRDNA Clean—Up Kit完成對DNA的純化，純化后的DNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2.3.2 PCR擴增

按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性及可靠性，需滿足兩個條件：盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴增；保證每個樣本擴增的循環(huán)數(shù)一致。隨機選取具有代表性的樣本進行預(yù)實驗，確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣本能夠擴增出濃度合適的產(chǎn)物。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型；

全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

2.3.3 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。

2.3.4 Illumina平臺文庫構(gòu)建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

2.3.5 Illumina平臺測序

DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上，另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋 (bridge)”，PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇，DNA擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種，將“熒光基團”和“終止基團”化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

2.3.6 生物信息化流程

使用的Usearch軟件(version 7.1) ，根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。然后在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU的代表序列作分類學(xué)分析[10]?；贠TU聚類分析結(jié)果，可以對OTU進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學(xué)信息，可以在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析；基于系統(tǒng)發(fā)育可以進行unifrac等分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，可以進行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析[11-12]。

3 結(jié)果與討論

3.1 土壤的理化性質(zhì)

分析發(fā)酵液淋洗后對土壤理化性質(zhì)的影響，如表1。與原始土壤比較，發(fā)酵液淋洗后土壤中pH略有下降，酸性略有增強，主要是由于發(fā)酵液的酸性較強，使土壤中pH略有降低，土壤的緩沖體系使其變化值不大。另一方面，由于土壤中的離子含量較高，使淋洗后的土壤中陽離子交換量增加，有機質(zhì)、氮、磷等營養(yǎng)元素明顯增加，可一定程度上改善土壤的肥力，這與污泥發(fā)酵液施用土壤后的情況類似[13]。而淋洗12 h與淋洗24 h比較發(fā)現(xiàn)，土壤的理化性質(zhì)變化不大，營養(yǎng)成分略有增加。這可能是因為發(fā)酵液呈酸性，且其中含有大量的有機物和無機鹽，淋洗后土壤肥力增加；淋洗12 h后，土壤中的發(fā)酵液已近于飽和，再淋洗至24 h后，土壤理化性質(zhì)變化不大。

表1 土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of soil

3.2 物種豐度及Alpha多樣性分析

6種土樣分別進行高通量測序, 6份樣品的有效序列數(shù)分別為42 255,33 596,38 939,37 953,32 372,31 916條,說明六種土壤中微生物種類豐富，數(shù)量較大[14]。為了保證樣本測序序列的均一性，按照樣本序列最低數(shù)量，將所有樣本的序列隨機抽取至統(tǒng)一數(shù)據(jù)量，方進行后續(xù)分析。計算發(fā)現(xiàn)樣品覆蓋率平均為99.432 2%，基于OTU統(tǒng)計結(jié)果繪制稀釋曲線如圖1所示，隨著測序數(shù)量的增加，各樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，表明我們的取樣基本合理，置信度高，能夠比較真實的反映樣品的細菌群落。97%的相似度下的物種豐度中，W-2和UV豐度最小，0，L-1，L-2和W-1豐度基本相同，相對較大。說明發(fā)酵液淋洗后微生物豐度變化不大，用水淋洗和紫外光照射的情況下，土壤中微生物豐度下降。

圖1 稀釋曲線Fig.1 The dilution curve

各個樣品Alpha多樣性指數(shù)如表2所示，Shannon指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)越大，simpson指數(shù)越小，表明物種越豐富[15]。0，W-1的Shannon指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)均高于W-2，simpson指數(shù)均小于W-2，進一步說明用水淋洗后土壤中物種豐度減小?？赡苁且驗樗诌^量引起土壤中養(yǎng)分流失，有效利用養(yǎng)分的減少使土壤中細菌數(shù)量減少，也可能是因為水分過撈致使土壤通氣不暢，抑制了部分好氣細菌的增長。而0，L-1，L-2的Shannon指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)、simpson指數(shù)相近各有大小，進一步說明它們的物種豐度變化不大?？赡苁且驗樵纪寥乐袪I養(yǎng)充足，適合微生物生長，雖然土壤理化性質(zhì)有較大改變，但微生物的多樣性變化不大。比較0，L-1與UV的Alpha多樣性指數(shù)，也可得到結(jié)論L-1的物種豐度大于UV，由于紫外光具有殺菌消毒作用，可抑制微生物的增長，因此紫外光照射下微生物豐度下降[16]。

表2 序列統(tǒng)計及Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 The number of OTU and The Alpha diversity indexs of bacteria in each sample

3.3 主成分及熱圖分析

為分析土壤中微生物差異，進行OTU豐度的PCA分析，如圖2所示。分析表明主成分1 (PC1)和主組分2(PC2)在樣品差異性貢獻率上分別達到84.68%和12.63%,合計達到97%,是差異的主要來源。不同顏色代表不同的樣品，樣品間距離代表其相似性。L-1與原始土壤距離最近，說明其在主成分上具有相似性。因為L-1淋洗時間較短，微生物變化不大。而L-2和W-2則比較分散，說明在發(fā)酵液和水淋洗24 h后，復(fù)合菌系中微生物組成存在顯著差異。

圖3為門水平上的熱圖，不同顏色表示各門在樣品中的豐度，進化樹表明樣品間的相似程度[17]。從顏色分布可以看出，各個樣品在門水平上的差異較小。圖3進化樹可知0，L-1，L-2發(fā)生聚類，W-2相比W-1與這三種樣品差別更大，與上述PCA分析結(jié)果一致，既原始土壤與發(fā)酵液淋洗后的土壤中的微生物群落在門水平上相似，而水淋洗后土壤中的微生物差異較大，淋洗時間較長，差異越大。餐廚垃圾發(fā)酵液中含有眾多的微生物，并且與土壤中含有的微生物具有差異。當(dāng)發(fā)酵液與土壤進行混合淋洗時，由于酸堿性、有機質(zhì)等理化性質(zhì)的差異，導(dǎo)致混合體系中優(yōu)勢菌群發(fā)生改變，從而導(dǎo)致土壤中微生物群落的變化[18-19]。土壤淋洗過12 h后，理化性質(zhì)發(fā)生迅速改變，但是微生物的增殖具有一定的適應(yīng)期，其變化表現(xiàn)出一定的滯后性，因此會帶來L-2與L-1，W-2與W-1的差異?？赡苁且驗樗芟春?，改變了土壤環(huán)境，部分微生物流失或死亡，微生物群落差異顯著；而發(fā)酵液淋洗后，土壤中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物群落在門水平變化不大。

圖2 PCA分析圖Fig.2 The analysis chart of PCA

圖3 樣品在門水平的熱圖Fig.3 Heatmap of samples at phylum level

3.4 細菌組成多樣性及差異分析

對 OTU 依次進行門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)分類，分析其微生物組成[20]。6個樣品中細菌共分布在34個門，其中主要有9個門，所占比例如圖4所示。在所考察的原始土樣中，Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)均為優(yōu)勢菌門，比例分別為20.6%、44.2%、10.7%。水淋洗的土壤樣品W-2中變形菌門的比例大幅度提升為84.1%。發(fā)酵液淋洗12h(L-1)土壤中厚壁菌門減少至34.0%，酸桿菌門增至17.8%；但淋洗24h(L-2)后，酸桿菌門卻降至8.4%，厚壁菌門增至46.8%。

屬分類水平上共檢測到370多種微生物，如圖5所示，Bacillus(芽孢桿菌屬)為原始土樣的優(yōu)勢菌，占30.5%，其次為Lactococcus(乳球菌屬)占7.9%。L-1與原始土壤中優(yōu)勢菌相同，芽孢桿菌屬占26.5%，乳球菌屬下降為2.2%。淋洗足夠長時間后，L-2中優(yōu)勢菌為Lactobacillus(乳桿菌屬)，比例為26.1%，芽孢桿菌屬下降至12.4%，而水24h后優(yōu)勢菌種為Novosphingobium(新鞘脂菌屬)，比例為66.1%，芽孢桿菌屬下降至3.1%，Dechloromonas(氯單胞菌屬)上升至12.2%。

圖4 樣品在門水平上細菌類群比較Fig.4 Comparison of bacteria groups in each sample at phylum level

圖5 樣品在屬水平上細菌類群比較Fig.5 Comparison of bacteria groups in each sample at genus level

4 結(jié) 論

4.1 利用高通量測序技術(shù)分析樣品，平均覆蓋率為99.432 2%，測序結(jié)果能夠全面的反映樣品組成及結(jié)構(gòu)。多樣性指數(shù)可得土壤樣品的物種豐富度順序為：原始土壤、淋洗液淋洗>水淋洗>紫外照射下的淋洗液淋洗。

4.2 根據(jù)PCA分析和門水平聚類圖，原始土壤與發(fā)酵液淋洗土壤微生物群落類似，水淋洗時間越長，與原始土壤的微生物群落差別越大。

4.3 原始土壤中優(yōu)勢菌為Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)，比例分別為20.6%、44.2%、10.7%。發(fā)酵液淋洗土壤類似，但比例分別為20.0%～22.0%、34.0%～46.8%、8.4%～17.8%。水淋洗12 h變化不大，淋洗24 h后土壤優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(變形菌門)，比例為84.08%。原始土壤的優(yōu)勢菌屬為Bacillus(芽孢桿菌屬)，占30.5%，發(fā)酵液淋洗24 h后優(yōu)勢菌屬為Lactobalius(乳桿菌屬) 和Bacillus(芽孢桿菌屬)，比例分別為26.1%、12.41%，水淋洗24 h后優(yōu)勢菌屬為Novosphingobium(新鞘脂菌屬)和Dechloromonas(脫氯單胞菌屬)，比例分別為66.1%、12.21%。