李愛平，田 靜，周芝文，楊期明，周文勝

(湖南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410016)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后常見的神經(jīng)精神并發(fā)癥，其患病率逐年升高[1]，并且至少1/3患者在缺血性腦卒中后會(huì)出現(xiàn)心境改變[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PSD是各種神經(jīng)生物學(xué)和社會(huì)心理因素綜合作用的結(jié)果[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者或動(dòng)物模型存在海馬神經(jīng)元再生減少、海馬體積變小，而且抗抑郁藥物可以增加海馬神經(jīng)元再生[5]，提示海馬神經(jīng)元的再生障礙可能也參與了PSD的發(fā)生。本研究將建立PSD大鼠模型，并觀察大鼠的行為學(xué)變化及其海馬齒狀回神經(jīng)元的新生情況，探索氟西汀對(duì)PSD模型大鼠的治療作用及生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠40只(SPF級(jí))，體重240～260 g，購(gòu)于湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(湘)2015-0013]。福利倫理審查號(hào)(倫審科2016第006號(hào))，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氟西汀購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號(hào)：MB1555)。MCAO硅膠栓線購(gòu)于廣州佳靈生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品規(guī)格：L3600)。微小染色體維持蛋白2抗體(Anti-MCM2 Antibody) 購(gòu)于武漢博士德生物有限公司(產(chǎn)品編號(hào)：BM4086)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

在室溫(20 ± 2)℃和相對(duì)濕度為50% ～ 60%的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠一周，大鼠自由進(jìn)食和飲水，予以人工12 h晝夜循環(huán)照明(7:00 ～ 19:00光照)，隔日定時(shí)清潔籠舍。期間測(cè)定敞箱試驗(yàn)(open field test, OFT)、蔗糖偏愛試驗(yàn)(sucrose preference test, SPT)基線評(píng)分。篩選符合條件(OFT基線評(píng)分為30～ 120分)的大鼠40只隨機(jī)分成2組：手術(shù)組(n=32)和假手術(shù)組(n=8)。手術(shù)組行大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)術(shù)，術(shù)后24 h評(píng)分≥1分且<4分(按照Longa等[6]標(biāo)準(zhǔn))的大鼠24只再隨機(jī)分成3組：卒中組(n=8)，每籠3～4只飼養(yǎng)；PSD 組(n=8)，MCAO術(shù)后第2天加以慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)結(jié)合獨(dú)籠飼養(yǎng)；氟西汀組(n=8)，MCAO術(shù)后第2天即開始CMUS刺激結(jié)合獨(dú)籠飼養(yǎng)，自第15天起每日一次腹腔注射氟西汀(劑量為5 mg/kg體重)[7]進(jìn)行干預(yù)，共用藥3周。假手術(shù)組除不插入栓線外，其他處理同卒中組。

1.3.2 PSD模型建立

首先參照Longa等[6]方法建立永久性MCAO模型，術(shù)中參照包新杰等[8]研究結(jié)果確定插入栓線深度為(18±1)mm。MCAO術(shù)后第2天,參照Willner[9]和Katz[10]報(bào)道的CUMS方法給予應(yīng)激：①禁食禁飲20 h；②禁飲17 h；③45°斜置鼠籠17 h；④持續(xù)照明17 h；⑤濕籠(100 g墊料+200 mL水)21 h；⑥4℃水強(qiáng)迫游泳5 min；⑦水平震蕩鼠籠5 min；⑧行為約束2 h；⑨夾尾1 min，以上9種應(yīng)激每天隨機(jī)采取一種，并采用單籠飼養(yǎng)。

1.3.3 行為學(xué)評(píng)價(jià)

各組大鼠術(shù)前基線期(0 d)及術(shù)后第7、14、21、28和35天分別測(cè)量體重，并進(jìn)行SPT和OFT，而強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)(forced swim test，F(xiàn)ST)僅在第35天末次應(yīng)激后進(jìn)行。

(1)蔗糖偏愛試驗(yàn) 借鑒Willner等方法[9]加以改進(jìn)。首先予1%蔗糖水飼養(yǎng)48 h，再禁水4 h，然后暴露1 h于兩個(gè)完全相同的瓶子(一個(gè)盛滿1%蔗糖水，另一個(gè)盛滿普通飲用水)。測(cè)定此1 h內(nèi)蔗糖水消耗體積與總消耗體積(蔗糖水+飲用水)的比值。

(2)敞箱試驗(yàn) 參照Papp等方法[11]所用敞箱長(zhǎng)寬均為 80 cm、高為40 cm，內(nèi)空的立柱體，壁周為黑色，底面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動(dòng)物穿越地面方塊數(shù)(四爪跨入)作為水平活動(dòng)得分，以直立次數(shù)(兩前肢離地l cm 以上)為垂直活動(dòng)得分，記錄5 min。室內(nèi)隔音，每次實(shí)驗(yàn)后均需將動(dòng)物排泄物清除干凈。

(3)強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 參照Porsolt等方法[12]，試驗(yàn)前1天將大鼠籠敞開飼養(yǎng)，第2天將大鼠放入一個(gè)盛水[(24±1)℃，45 cm深]的圓柱狀筒內(nèi)持續(xù)10 min，游泳過(guò)程用攝像機(jī)拍攝記錄。觀察最初5 min，累計(jì)大鼠在水中不動(dòng)、游動(dòng)或攀爬狀態(tài)的時(shí)間。

1.3.4 免疫組化

行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛按3 mL/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，先后用4℃生理鹽水及含1%蔗糖的1%多聚甲醛(PFA)進(jìn)行灌注，取腦于含1%蔗糖的1%PFA固定3 h，再移入4℃30%蔗糖溶液置冰箱中脫水沉底，制備海馬冠狀位冰凍切片(厚度20 μm)。取每只大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)最清楚的3張冰凍切片進(jìn)行微小染色體維持蛋白2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)免疫組化染色，在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取五個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的MCM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重的變化

各組大鼠在術(shù)前體重基線值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)，假手術(shù)組大鼠體重隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢增加，而卒中組、PSD組和氟西汀組大鼠體重在手術(shù)后前14天內(nèi)呈下降趨勢(shì)，自第21天時(shí)開始體重逐漸增加，其中卒中組和氟西汀組大鼠的體重增長(zhǎng)速度較PSD組大鼠明顯增快。與卒中組比較，PSD組大鼠的體重在第21、28和35天時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠的體重在第21、28和35天時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(見表1)。

2.2 蔗糖偏愛試驗(yàn)

各組大鼠蔗糖水消耗比例術(shù)前基線水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；MCAO術(shù)后第14、21、28、35天時(shí)，與卒中組比較，PSD組大鼠蔗糖水消耗比例均顯著減少(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠的蔗糖水消耗比例在第21、28和35天時(shí)顯著增加(P<0.05)(見表2)。

2.3 敞箱試驗(yàn)

各組大鼠術(shù)前水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分基線值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與卒中組比較，PSD組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分在第21、28和35天時(shí)顯著下降(P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀干預(yù)后大鼠在第21、28和35天時(shí)水平運(yùn)動(dòng)得分明顯增加(P<0.05)(見表3)。

各組大鼠術(shù)前垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分基線值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與卒中組比較，PSD組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)得分在第28和35天時(shí)明顯下降(P<0.05)；與PSD組比較，氟西汀干預(yù)后大鼠在第28和35天時(shí)垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著增加(P<0.05)(見表4)。

2.4 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)

與假手術(shù)組、卒中組比較，PSD組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)，游動(dòng)及攀爬時(shí)間顯著縮短(P<0.01)；與PSD組相比，氟西汀干預(yù)后大鼠不動(dòng)時(shí)間顯著縮短(P<0.01)，游動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)(見表5)。

2.5 海馬齒狀回新生神經(jīng)元的變化

采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠海馬齒狀回區(qū)MCM2的表達(dá)，分析海馬中新生神經(jīng)元增生的變化。結(jié)果顯示，在大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，可見MCM2主要表達(dá)于細(xì)胞核，MCM2陽(yáng)性細(xì)胞局限于顆粒細(xì)胞層和門區(qū)之間的顆粒細(xì)胞下層，一般不會(huì)超過(guò)顆粒細(xì)胞層內(nèi)1/3(見圖1)。與卒中組比較，PSD組大鼠海馬齒狀回的MCM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(H=109.30和P<0.01)；與PSD組比較，氟西汀組大鼠海馬齒狀回的MCM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(H=149.74,P<0.01)(見圖2)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體重變化Table 1 Weight changes of the rats in each group at various time points

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的蔗糖水消耗比例Table 2 Volume ratio of sucrose water consumption of the rats in each group at various time points

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表3 各組大鼠在敞箱試驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)的水平運(yùn)動(dòng)得分Table 3 Comparisons of horizontal movement scores in the open field test of rats in each group

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表4 各組大鼠在敞箱試驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)的垂直運(yùn)動(dòng)得分Table 4 Comparisons of vertical movement scores in the open field test of rats in each group

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：a：大鼠海馬齒狀回；b：黑色箭頭示MCM2+細(xì)胞。圖1 大鼠海馬齒狀回MCM2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)定位Note. a: Hippocampal dentate gyrus of rats; b: MCM2+ cells (black arrow).Figure 1 Localization of MCM2+ cells in the hippocampal dentate gyrus of rats

組別Groups不動(dòng)時(shí)間(s)Immobility time游動(dòng)時(shí)間(s)Swimming time攀爬時(shí)間(s)Climbing time假手術(shù)組Control group40.50±7.82*120.25±8.24*139.25±11.55*卒中組Stroke group44.63±10.76*119.38±12.81*136.00±22.30*PSD組PSD group108.63±14.4686.75±10.51104.63±13.42氟西汀組Fluoxetine group50.25±13.09*132.12±16.48*117.63±11.60

注：與PSD組比較，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01；與卒中組比較，△P<0.01；與PSD組比較， ※P<0.01。圖2 大鼠海馬齒狀回MCM2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量對(duì)比Note. Compared with the control group, #P<0.01; compared with the stroke group, △P<0.01; compared with the PSD group, ※P<0.01.Figure 2 Comparisons of MCM2+ cell numbers in the hippocampal dentate gyrus of rats in each group

3 討論

PSD是腦卒中后出現(xiàn)的一種精神情感障礙，它是卒中后腦部特定功能結(jié)構(gòu)的損傷以及各種心理和社會(huì)應(yīng)激的共同結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)線栓法制備腦缺血卒中模型，再運(yùn)用孤養(yǎng)法及CMUS法聯(lián)合模擬卒中后的負(fù)性壓力環(huán)境制備PSD模型大鼠。該模型廣泛應(yīng)用于PSD發(fā)病機(jī)制和藥物療效評(píng)價(jià)研究，其原理是嚙齒類動(dòng)物在經(jīng)歷一系列CMUS應(yīng)激后，會(huì)出現(xiàn)快感缺失、興趣及運(yùn)動(dòng)下降、探索行為下降等抑郁行為特征[13-14]。

體重減輕是CMUS模型大鼠的重要特征之一，其原因可能是由于大鼠情感抑郁、食欲下降導(dǎo)致體重增加緩慢，但也可能是應(yīng)激過(guò)程中采用了禁食禁水刺激，直接導(dǎo)致體重增加緩慢[15]。因此，體重的減輕可以反映應(yīng)激事件對(duì)大鼠的負(fù)面影響，但不能作為衡量PSD大鼠模型建立是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。SPT是根據(jù)大鼠對(duì)甜味的偏好而設(shè)計(jì)的一種檢測(cè)方法，反映了大鼠體驗(yàn)快樂(lè)的能力，常用來(lái)評(píng)價(jià)抑郁大鼠的快感缺失癥狀[9]。OFT是反映大鼠對(duì)未知環(huán)境的探索能力及情緒反應(yīng)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，主要評(píng)價(jià)抑郁大鼠對(duì)外界的探索行為和好奇心下降等癥狀[11]。FST通過(guò)評(píng)估大鼠在游泳中出現(xiàn)的靜止不動(dòng)、游動(dòng)或攀爬三種狀態(tài)，反映大鼠的悲觀絕望樣行為特征[12]。但也有一些學(xué)者認(rèn)為，強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中動(dòng)物的靜止?fàn)顟B(tài)可能只是一種適應(yīng)或疲勞現(xiàn)象，而不是真正的絕望行為[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用體重變化、SPT、OFT和FST等四個(gè)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)估PSD大鼠模型的建立及氟西汀的干預(yù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSD模型大鼠在CMUS應(yīng)激后第7、14天時(shí)體重下降幅度較卒中組大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在第21、28和35天時(shí)體重的增加較卒中組大鼠明顯減慢，提示隨著應(yīng)激事件的累積，PSD模型大鼠的體重增長(zhǎng)受到了負(fù)面影響，該結(jié)果與既往研究報(bào)道一致。而與卒中組大鼠比較，PSD模型大鼠的蔗糖水消耗比例(第14、21、28、35天)、OFT中的水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分(第28和35天)均顯著下降，而且在CMUS后第35天進(jìn)行的FST顯示PSD模型大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)、游動(dòng)及攀爬時(shí)間顯著縮短。以上結(jié)果顯示，CMUS刺激累積一段時(shí)間后，PSD模型大鼠表現(xiàn)出來(lái)的抑郁樣行為特征越來(lái)越顯著，也表明PSD大鼠模型建立成功。此外，與PSD組大鼠比較，氟西汀干預(yù)后的PSD模型大鼠的體重、蔗糖水消耗比例、水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分、游泳中的不動(dòng)時(shí)間均有明顯改善，說(shuō)明氟西汀能改善PSD模型大鼠的抑郁癥狀。

MCM2蛋白是一種基因復(fù)制相關(guān)蛋白，存在于細(xì)胞核，是檢測(cè)海馬神經(jīng)元新生的常用標(biāo)記物[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)歷MCAO術(shù)的大鼠海馬齒狀回MCM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，可能是急性卒中應(yīng)激誘發(fā)了海馬神經(jīng)元新生和重塑；但CMUS聯(lián)合孤養(yǎng)應(yīng)激后，大鼠海馬齒狀回的MCM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增幅明顯下降，并且氟西汀的干預(yù)可以部分逆轉(zhuǎn)這種下降趨勢(shì)。既往研究報(bào)道，5-羥色胺1A受體(5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1A)能介導(dǎo)5-HT對(duì)海馬齒狀回的神經(jīng)重塑起促進(jìn)作用，5-HT缺乏可引起海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生速度下降，進(jìn)而促發(fā)抑郁[18-19]；PSD患者大腦皮層中5-HT和去甲腎上腺素能(norepinephrine，NE)遞質(zhì)水平降低、邊緣系統(tǒng)和中縫核5-HT代謝速度顯著減慢、腦脊液中5-HT的代謝產(chǎn)物明顯下降[20-22]，PSD模型大鼠的額葉和海馬區(qū)5-HT和NE含量也明顯降低[23-24]，并且使用5-HT和NE再攝取抑制劑對(duì)PSD治療有積極作用[21,24]；也有學(xué)者認(rèn)為，腦卒中相關(guān)的炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)增多導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT的耗竭，從而導(dǎo)致PSD發(fā)生[25]。因此，5-HT及其相關(guān)代謝通路在PSD的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。氟西汀是一種選擇性5-HT再攝取抑制劑，臨床上常作為抗抑郁治療的一線用藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟西汀可以顯著改善PSD模型大鼠的抑郁樣行為，并且促進(jìn)海馬齒狀回的神經(jīng)元再生，這與另一種選擇性5-HT再攝取抑制劑(艾司西酞普蘭)類似[26]，但后者的抗抑郁作用起效更快，可能是因?yàn)閷?duì)海馬區(qū)神經(jīng)再生的影響更快[27]。綜上所述，海馬齒狀回的神經(jīng)再生障礙可能是PSD發(fā)病的重要機(jī)制之一，同時(shí)也可能是氟西汀等抗抑郁藥物作用的遠(yuǎn)隔效應(yīng)，但其具體機(jī)制仍有待從顯微形態(tài)學(xué)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、信號(hào)傳導(dǎo)等方面深入研究。