油九菊，柳敏海，殷小龍，李偉業(yè)，傅榮兵，徐志進

(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316000)

帶魚(Trichiurushaumela)是我國重要海洋經(jīng)濟魚類之一，主要分布于西太平洋和印度洋，在中國沿海海域均有分布。東海帶魚是東海區(qū)海洋漁業(yè)中產(chǎn)量最高的主要經(jīng)濟魚種，也是東?！八拇蠛．a(chǎn)”中唯一還能形成較大漁汛的傳統(tǒng)捕撈對象，在東海漁業(yè)中占據(jù)舉足輕重的地位。東海帶魚有春汛和冬汛之分，春季向北作生殖洄游，產(chǎn)卵時則洄游至淺海水域，帶魚產(chǎn)卵期很長，一般以4—6月為主，其次是9—11月。2017年7月，本單位率先在室內(nèi)成功開展帶魚人工馴養(yǎng)，填補了國內(nèi)空白，在帶魚運輸、保活、馴養(yǎng)等方面積累了寶貴的原創(chuàng)性經(jīng)驗。

魚類腸道微生物是魚體的重要組成部分，微生物、宿主及宿主所處的生態(tài)環(huán)境之間形成相互依賴、相互制約、又相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，宿主為微生物提供了棲息環(huán)境，而微生物對宿主的發(fā)育、營養(yǎng)、免疫和生理健康等方面都起著非常重要的作用。目前關(guān)于帶魚的研究報道，主要集中在資源調(diào)查、種群生物學、養(yǎng)殖技術(shù)等方面[1-5]，尚未見有關(guān)帶魚腸道菌群的研究。自然界中很大一部分細菌是不能通過實驗室培養(yǎng)而得到其純分離物，傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在著較大的局限性，而傳統(tǒng)分子生物學方法(如16S rDNA克隆文庫、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳等)又存在通量低的缺陷。但16S rRNA高通量測序技術(shù)可以對微生物環(huán)境中群落進行精確定量，具有通量高、錯誤率和成本低等特征[6-7]，已廣泛應(yīng)用于水體、土壤、動物等不同環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[8-9]。本研究利用16S rRNA高通量測序技術(shù)，初步分析了野生東海帶魚腸道菌群結(jié)構(gòu)特征，為深入了解東海帶魚的攝食特征、營養(yǎng)狀況等提供參考，也為東海帶魚種質(zhì)資源的保護和合理開發(fā)提供科學依據(jù)，以及為帶魚人工養(yǎng)殖技術(shù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品于2017年5月初，采自舟山市六橫島臺門海區(qū)，該海區(qū)潮流比較平緩，風浪適中，水深在6～9 m，海區(qū)底質(zhì)以泥沙為主，鹽度為23.0～27.5，溶解氧為6.5～8.2 mg/L。

1.2 樣品采集

現(xiàn)場隨機捕獲野生東海帶魚50尾，平均全長31.5 cm，平均體重20.8 g，平均肛長12.4 cm。挑選其中活力較好、體表完整無擦傷、剖檢內(nèi)臟無病灶的5尾帶魚，用75%濃度酒精棉球擦拭體表，無菌條件下取出整條腸道，再用75%酒精棉球擦拭腸道外壁，滅菌手術(shù)剪剪開腸道，解剖刀刮取各腸道內(nèi)容物，并混合為一個樣品后，置于50 mL滅菌離心管中，滅菌生理鹽水沖洗，清洗液與內(nèi)容物一并保存于-80℃。

1.3 腸道菌群總DNA的提取

按照Power Fecal DNA Isolation kit(MOBIO，USA)試劑盒說明書，提取腸道樣品菌群總基因組DNA。利用超微量核酸蛋白測定儀Merinton SMA4000 測定各DNA濃度及純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗核酸完整性。

1.4 PCR擴增及Illumina Miseq 測序

以樣品菌群總DNA為模板，采用引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′對微生物16S rRNA的V3～V4區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)5 μL，25 mmol/L MgCl2+4 μL，dNTP 4 μL，正、反向引物各 1 μL，DNA模板 2 μL，Ex Taq 0.25 μL，超純水補足50 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，利用E.Z.N.A.TM Cylcle-Pure試劑盒(Omega，USA)進行PCR產(chǎn)物的純化及回收。純化產(chǎn)物送至歐易生物醫(yī)學科技有限公司(上海)進行Illumina Miseq高通量測序及分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，得到優(yōu)化序列(Clean tags)，去除嵌合體后得到有效序列(Valid tags)，然后直接進行可操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類分析。OTU分類為人為定義的分類單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學或者群體遺傳學研究中，為了便于分析，人為給某一分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的同一標志[10]。對有效序列按照97%的相似度進行OTU分類?；贠TU聚類分析結(jié)果，評估樣本群落測序深度；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群樣品總基因組DNA質(zhì)量檢測

利用基因組DNA提取試劑盒，獲取了帶魚腸道菌群總基因組DNA，1.2%凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，電泳條帶較清晰；經(jīng)超微量核酸蛋白測定儀測定，DNA樣品濃度為103.85 ng/μL，A260/A280為1.94，A260/A230為2.15，表明所獲得樣品總基因組DNA濃度較高，純度、完整性較好。

注：M為DNA Marker；A、B為腸道菌群樣品。

Notes：M was 2 000 bp DNA ladder；A and B were intestinal flora samples.

2.2 樣品測序質(zhì)量分析

對Illumina 測序(MiSeq)得到的序列進行預(yù)處理，去除低質(zhì)量的堿基序列以及模糊堿基序列，共得到41 150條細菌序列，進一步去除嵌合體后得到36 129條有效序列(87.79%)，有效序列長度主要分布在401～450 bp之間，平均序列長度430 bp。以97%的序列相似度進行OTU聚類，共獲得245個OTUs。由圖2可知，在本試驗的測序深度下，樣品的稀釋曲線趨于平緩，即隨測序條數(shù)增加，獲得的OTU數(shù)量變化不大，腸道樣品序列覆蓋率Good’s coverage指數(shù)為100%，說明本試驗測序深度足夠大，足以覆蓋樣品的大多數(shù)微生物，測序的數(shù)據(jù)量合理。

2.3 帶魚腸道菌群分類組成

2.3.1 門分類水平上的菌群組成

基于97%的相似度進行OTU聚類分析，統(tǒng)計腸道樣品包含的OTU種類以及每個OTU中含有序列的比例。并且對每個OTU挑選出代表序列，同時將所有代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫[11]比對，通過RDP classifier[12]Naive Bayesian分類算法對代表序列進行分類注釋。在245個OTUs、36 129條有效序列中有4條序列無法進行物種分類(0.01%)，其余244個OUTs分屬于16個細菌門。如圖3所示，東海帶魚腸道菌群中相對豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria，52.30%)，其次為厚壁菌門(Firmicutes，30.66%)，此外擬桿菌門(Bacteroidetes，8.43%)、藍藻門(Cyanobacteria，3.30%)、梭桿菌門(Fusobacteria，1.68%)等也占有一定比例。

2.3.2 其它分類水平上的菌群組成

從綱、科、屬的水平上看，東海帶魚腸道菌群主要分屬于29個綱、77個科、127個屬。在綱的水平上，以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，51.11%)和梭菌綱 (Clostridia，28.56%)為主；在科水平上，優(yōu)勢菌主要是弧菌科(Vibrionaceae，49.38%)，其次是梭菌科(Clostridiaceae_1，25.40%)；在屬的水平上，發(fā)光桿菌屬(Photobacterium，47.90%)和分節(jié)絲狀菌(Candidatus_Arthromitus，17.04%)為主要的屬。OTU優(yōu)勢度最高的10個綱、科和屬見表1。

表1 東海帶魚腸道菌群優(yōu)勢度最高的10個綱、科和屬

3 討論

對魚類腸道菌群組成的研究，國內(nèi)外已有相關(guān)報道[13-23]。本文以現(xiàn)場捕撈的東海淺海區(qū)生活的鮮活帶魚為試驗對象，對東海帶魚腸道微生物環(huán)境進行初步分析，希望為人工馴養(yǎng)、餌料選擇、健康狀態(tài)評估等提供理論依據(jù)。據(jù)報道，腸道菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量與魚的種類、棲息水域、餌料狀況和生理狀況等相關(guān)[15-16]。周金敏等[15]利用培養(yǎng)法分別從養(yǎng)殖黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)腸道及水體中分離出9類和11類細菌；尹雪梅等[17]通過PCR-DGGE技術(shù)分析了養(yǎng)殖河鲀腸道細菌組成，獲得了29個OTUs，且有8個OTUs相似度低于98%；王程程等[16]也利用PCR-DGGE技術(shù)對福建三沙灣養(yǎng)殖大黃魚腸道菌群進行研究，僅獲得了8個OTUs，雖然克服了對培養(yǎng)方法的依賴，但存在測序量低的缺陷。本文采用Illumina高通量測序技術(shù)分析了野生東海帶魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，測序獲得有效序列36 129條，基于97%相似度原則，聚類歸為245個OTUs；OTU稀釋曲線序列覆蓋率達100%，表明本測序結(jié)果可客觀真實地反映出野生東海帶魚腸道菌群結(jié)構(gòu)組成。

以往對魚類腸道菌群的研究表明，變形菌門和厚壁菌門是最普遍和共同存在于魚類腸道中的細菌類群，且擬桿菌門在不同的魚類腸道中以較低豐度存在[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，東海帶魚腸道菌群在門的水平上，以變形菌門為最主要的優(yōu)勢菌，其次是厚壁菌門，擬桿菌門占有一定比例(8.46%)，門水平上的菌群組成與大多數(shù)魚類一致。本研究中還發(fā)現(xiàn)腸道中有梭桿菌門、未知菌群等的存在，但豐度較低(均<3.30%)。在綱的水平上，γ-變形菌綱為優(yōu)勢菌，其次為梭菌綱，這與Roeselers等[19]關(guān)于模式生物斑馬魚腸道微生物的研究結(jié)果一致。福建養(yǎng)殖大黃魚腸道內(nèi)容物菌群以梭菌綱為優(yōu)勢菌，γ-變形菌綱位列其次，東海帶魚則與之相反，這與宿主居住的水體環(huán)境、季節(jié)變化、餌料類型、個體發(fā)育期、生理狀態(tài)等因素可能存在一定的關(guān)聯(lián)。后期將在不同個體發(fā)育時期、不同海區(qū)等東海帶魚腸道細菌的群落結(jié)構(gòu)組成、胃容物、營養(yǎng)及生理狀況等方面展開深入探索，以不斷豐富野生東海帶魚生物學基礎(chǔ)信息，為野生東海帶魚種質(zhì)資源保護及后期合理開發(fā)等提供理論依據(jù)。

諸多研究表明，淡水魚和海水魚腸道中優(yōu)勢菌分別與水體環(huán)境中的優(yōu)勢菌相類似，在科、屬的水平上，淡水魚類腸道菌群多以氣單胞菌屬及腸桿菌科等為優(yōu)勢菌群[15，21]，而海水魚腸道多以喜鹽的弧菌屬(Vibrio)為主[22-23]。野生東海帶魚腸道菌群以弧菌科的發(fā)光桿菌屬和梭菌科的分節(jié)絲狀菌為主要的屬，均屬于腸道菌屬，但與海水魚腸道菌群研究相關(guān)報道結(jié)果不一致，這可能是由東海帶魚的索餌場餌料狀態(tài)、水質(zhì)狀況、自身生理狀況等各種因素所致，也可能是試驗魚對離水取樣操作產(chǎn)生了強烈的應(yīng)激性反應(yīng)的結(jié)果，具體原因還需深入探索。宛立等[24]、楊鶯鶯等[25]采用培養(yǎng)法鑒定出南美白對蝦腸道中的優(yōu)勢菌為發(fā)光桿菌屬、弧菌屬和氣單胞菌屬，而在魚類中未見發(fā)光細菌屬為優(yōu)勢菌的報道。本研究還發(fā)現(xiàn)，帶魚腸道中分節(jié)絲狀菌(SFB)占據(jù)17.04%的比例，動物模型研究證明SFB直接參與宿主腸道免疫系統(tǒng)的成熟[26]，這對野生帶魚在自然海區(qū)狀態(tài)下，腸道免疫機制的建立及免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮等都具重要意義。