游劍濤

(廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，廈門361102)

大黃魚(Larimichthyscrocea)，隸屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Larimichthys)，主要分布在我國黃海南部、東海、臺灣海峽以及南海[1]，是中國近海特有的主要經(jīng)濟魚類和當(dāng)前主要的海水養(yǎng)殖魚類之一，也是中國六大優(yōu)勢出口水產(chǎn)品之一[2]。據(jù)《2017中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》記錄，2016年全國大黃魚產(chǎn)量為165 496 t，其中福建省養(yǎng)殖產(chǎn)量為146 514 t，占全國比重的88.53%[3]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大、養(yǎng)殖環(huán)境的逐漸惡化，病害問題已成為制約大黃魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸，近年流行的病害主要是細(xì)菌性疾病(弧菌病、假單胞菌病等)、寄生蟲病(本尼登蟲病、刺激隱核蟲病、淀粉卵甲藻病)、病毒病(虹彩病毒病)和真菌病等[4-5]。其中，細(xì)菌是較為嚴(yán)重的病原之一，流行時間為6—10月，其中7—8月為高峰期，一般死亡率為30%～40%，每年都給養(yǎng)殖者造成了極大的經(jīng)濟損失[6]。目前已有由惡臭假單胞菌[7-8]、香魚假單胞菌[9]、副溶血弧菌[10]、費氏弧菌[11]、溶藻弧菌[12]等引起養(yǎng)殖大黃魚細(xì)菌性疾病的報道。2013年福建寧德網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚出現(xiàn)發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為魚體表黏液多，鰓絲潰爛、鰓耙裸露，呼吸困難，解剖后可見有腹水、脾臟腫大且顏色深、腎臟腫大；本文從患病的大黃魚鰓部分離純化1株優(yōu)勢菌株，通過回歸感染試驗確認(rèn)其為致病菌，并開展了分離菌株、生理生化、16S rRNA序列分析鑒定和藥敏試驗。本結(jié)果為大黃魚爛鰓病的病原確定和防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

PCR儀購自美國Thermo公司；普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；藥敏試紙和細(xì)菌生化反應(yīng)管購自杭州天河微生物試劑有限公司；pMD19-T載體購自Takara公司。

1.2 致病菌分離

患病大黃魚于2013年9月采自福建省福鼎市沙埕港大黃魚養(yǎng)殖漁排，選擇具有典型患病癥狀的瀕死魚體用于觀察患病癥狀和病原分離。用滅菌海水清洗患病大黃魚體表，無菌條件下取病魚鰓等組織材料，無菌勻漿后用普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS平板細(xì)菌劃線分離，28℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落用2216E培養(yǎng)基純化培養(yǎng)2～3次，經(jīng)純化后的菌株用30%甘油生理鹽水保存于-80℃冰箱。

1.3 人工感染試驗

選擇90條無外傷、活力強，重量約150 g的健康大黃魚置于養(yǎng)殖桶(500 L)暫養(yǎng)1周，然后進(jìn)行回歸感染試驗，設(shè)置人工感染試驗組和對照組，每組10尾，每組設(shè)3個平行。將1.2分離得到的菌株用2216E液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)18～20 h后，用無菌生理鹽水稀釋配制成濃度1×108CFU/mL和1×106CFU/mL兩個濃度梯度的細(xì)菌懸液。參照有關(guān)文獻(xiàn)[12]，人工感染試驗組采用腹腔注射細(xì)菌懸液(0.3 mL/尾)，對照組注射無菌生理鹽水(0.3 mL/尾)。試驗期間每天換水。感染后連續(xù)觀察14 d，記錄各組大黃魚發(fā)病及死亡情況。選擇人工感染試驗患病的瀕死魚，從鰓等組織再次分離細(xì)菌，優(yōu)勢菌株與人工感染試驗所用原菌株的菌落形態(tài)一致，純化后進(jìn)行人工感染試驗，根據(jù)感染后的魚體患病癥狀與重分離細(xì)菌的鑒定結(jié)果確定其為病原菌。

1.4 菌株鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(第10版)[14]進(jìn)行分類鑒定。取分離的純培養(yǎng)菌，接種于普通肉湯培養(yǎng)基，使用革蘭氏染色試劑盒、試管半固體培養(yǎng)基法和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管測定細(xì)菌生化指標(biāo)，鑒定指標(biāo)包括革蘭氏染色、運動性、葡萄糖氧化發(fā)酵、葡萄糖產(chǎn)氣、氧化酶、觸酶、葡萄糖磷酸鹽(V-P試驗)等。

病原菌16S rRNA序列分析所用的PCR引物分別為27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R-5’ACGGCTACCTTGTTACGACTT。在50μL體系里分別加入25 μL 10×PCR mix、2 μL DNA模板、0.4 μmol/L引物。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，接著94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 2 min循環(huán)35次，72℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產(chǎn)物，預(yù)期大小的擴增條帶切膠回收后克隆至pMD19-T載體，而后送至Invitrogen公司測序。用NCBI-BLAST軟件進(jìn)行序列比對，用ClastalX 1.83軟件進(jìn)行多重序列匹配和聚類分析，用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株藥敏試驗

采用瓊脂平板擴散法[15]對分離菌株進(jìn)行藥敏檢測，將培養(yǎng)至對數(shù)期的純化培養(yǎng)菌株均勻涂布在2216E平板上，貼上藥敏紙片，每種藥物貼3個紙片，于28℃培養(yǎng)20 h后測定所有檢測藥物的抑菌圈直徑。參照各藥物的敏感性標(biāo)準(zhǔn)確定該致病菌對不同藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 致病菌的分離及致病性確定

患病大黃魚活力弱，體表黏液多，鰓絲潰爛、軟骨裸露，呼吸困難；解剖后可見有腹水、脾臟腫大且顏色深、腎臟腫大(圖1)，從患病大黃魚鰓中分離得到1株優(yōu)勢菌，命名為Lc-2013-G1。

將菌株Lc-2013-G1分別以1×108CFU/mL和1×106CFU/mL的菌濃度采用腹腔注射人工感染健康大黃魚后，健康魚體從第2 d開始先后出現(xiàn)游動遲緩、活力減弱，鰓絲潰爛、呼吸困難癥狀，解剖后可見發(fā)病魚體腹水、脾腎腫大，并逐步出現(xiàn)死亡，其中1×108CFU/mL試驗組魚體全部死亡，而1×106CFU/mL試驗組的平均死亡率為33.33%，發(fā)病癥狀與自然感染發(fā)病魚體基本一致；對照組中大黃魚基本正常(表1)。

從注射感染后瀕死的大黃魚體內(nèi)重新分離得到優(yōu)勢菌CF-K-002，經(jīng)鑒定與Lc-2013-G1生理生化一致(表2)。

表1 人工感染試驗結(jié)果

2.2 菌株鑒定

分離菌株Lc-2013-G1和重分離菌株CF-K-002為革蘭氏陰性菌、弧桿狀，具有運動性；在普通營養(yǎng)瓊脂上形成圓形不透明菌落，菌落光滑、表面濕潤、邊緣整齊，24 h培養(yǎng)后直徑為1.0～1.5 mm；在TCBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后菌落呈黃色，直徑為2.0～3.0 mm，表面光滑、濕潤，邊緣整齊(圖2)。

生理生化分析結(jié)果表明，菌株Lc-2013-G1和重分離菌株CF-K-002均在1%、4%、6%氯化鈉中生長，在8%和10%氯化鈉中不生長；對V-P、阿拉伯糖、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解酶、硫化氫、明膠、鳥氨酸脫羧酶、尿素、檸檬酸鹽、乳糖、苦杏仁甙和蔗糖等顯陰性；對半乳糖、觸酶、淀粉酶、甘露醇、賴氨酸脫羧酶、麥芽糖和葡萄糖(產(chǎn)氣)等顯陽性(表2)。

病原菌Lc-2013-G1的16S rRNA序列擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆并測序，獲得長度為1 493 bp的基因序列，登陸NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對，結(jié)果顯示致病菌Lc-2013-G1與數(shù)據(jù)庫中Vibrioponticus(NR 029032.1、KC884589.1和JQ409384.1)的同源性最高；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，病原菌Lc-2013-G1與Vibrioponticus聚為一支，系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)性最高(圖3)。

結(jié)合生理生化和16S rRNA序列分析結(jié)果，確定病原菌Lc-2013-G1為弧菌屬(Vibrio)的Vibrioponticus。

表2 致病菌Lc-2013-G1和重分離菌CF-K-002的生理生化特征

續(xù)表2

注：+.陽性；-.陰性。

Notes：+.Positive；-.Negative.

2.3 分離菌株藥敏試驗

藥敏結(jié)果表明，分離菌株對氨芐西林、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、氯霉素、諾氟沙星、哌拉西林、慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西叮、頭孢唑林、氧氟沙星、左氟沙星等16種藥物敏感；對氨曲南、呋喃妥因、頭孢呋辛、萬古霉素等4種藥物表現(xiàn)為中度敏感；對阿米卡星、阿奇霉素、苯唑西林、大觀霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、克拉霉素、克林霉素、鏈霉素、麥迪霉素、米諾環(huán)素、強力霉素、青霉素、四環(huán)素、頭孢吡肟、妥布霉素、乙酰螺旋霉素等18種藥物表現(xiàn)為耐藥(表3)。

表3 不同抗菌藥物對病原菌Lc-2013-G1的抗菌活性

續(xù)表3

注：R-耐藥；I-中度敏感；S-敏感。

Notes：R was resistance；I was moderate sensitivity；S was high sensitivity.

3 討論

大黃魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是海產(chǎn)名貴優(yōu)質(zhì)魚類，也是人們青睞的海產(chǎn)品之一，在我國福建、浙江、廣東沿海都有大規(guī)模的養(yǎng)殖。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖病害的發(fā)生也給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。有報道表明，大黃魚養(yǎng)殖過程中主要病害包括寄生蟲感染、細(xì)菌感染、病毒感染和真菌感染等。刺激隱核蟲病是危害大黃魚較為嚴(yán)重的疾病之一，主要癥狀為病魚體表散布細(xì)小白點，俗稱“白點病”，流行時間一般為每年5月至7月和9月至10月，流行水溫為22℃至28℃[16]?！皟?nèi)臟白點病”也是危害大黃魚的主要疾病之一，該病于2006年由王國良等首次報道，病魚體表和鰓基本完好，剖檢后可見脾腫大、腎糜爛，脾、腎出現(xiàn)直徑0.5～1.0 mm白色結(jié)節(jié)，累計死亡率可達(dá)50%以上[8]；諾卡氏菌[17]、惡臭假單胞菌[7-8]、香魚假單胞菌[4]均已被報道可引起大黃魚內(nèi)臟白點病的發(fā)生。“白鰓病”是近幾年出現(xiàn)的大黃魚的又一疾病類型，該病通常發(fā)生于每年7—9月，水溫25～27℃，發(fā)病魚是體長多為20 cm以上的成魚，累計死亡率在12%以上；病魚體表完好，無其他明顯病征，體色偏白，鰓絲呈極度貧血狀態(tài)、發(fā)白；解剖病魚可觀察到呈白色或黃色的肝臟、呈貧血狀態(tài)的腎臟以及腫大的脾臟[6]；病毒感染被認(rèn)為是引起該病的病原[6，18-19]。

在病原方面，“弧菌病”是引起大黃魚死亡的主要的細(xì)菌性疾病之一，以潰瘍和爛尾為最常見的癥狀[12]，其病程短、范圍廣、死亡率高，流行時間為6—10月，其中7—8月為高峰期，一般死亡率為30%～40%，最高可達(dá)80%以上[5]。在本文中，作者從患有爛鰓病的大黃魚鰓部分離了1株優(yōu)勢菌株Lc-2013-G1，通過回歸感染試驗確認(rèn)其為病原菌[20]，并從生理生化、16S rRNA序列分析等方法鑒定該菌為Vibrioponticus。V.ponticus是弧菌屬的一員，是2004年發(fā)現(xiàn)的一個新種， Macián等首次在西班牙海水貽貝和金頭鯛中分離得到該菌[21]；Xie等[22]的研究結(jié)果表明，弧菌V.ponticus可引起日本鱸魚(Lateolabraxjaponicus)出現(xiàn)體表潰瘍癥狀，患病魚體體表出現(xiàn)紅色印記，而后變成白色，最后形成穿孔狀潰瘍，死亡率達(dá)80%以上。

目前控制弧菌病的主要手段是應(yīng)用抗菌藥物治療，但藥物本身具有很多副作用，會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，給以后的治療造成困難[10]。由于近幾年我國對漁用違禁藥物的控制，導(dǎo)致大多數(shù)抗菌藥物均被列入水產(chǎn)禁用藥品，目前氟苯尼考作為為數(shù)不多的抗菌藥物可用于防治大黃魚弧菌病[23]。同時，越來越多的學(xué)者研究中草藥與抗生素聯(lián)合用藥對致病菌的作用效果及其安全性。鄭天倫等測定了15種中草藥對大黃魚病原菌——溶藻弧菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)以及最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)，結(jié)果表明石榴皮、地榆、五味子、大黃等4種藥物對溶藻弧菌具有較強的抑菌能力[24]；李思源等選用6種中草藥對弧菌進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果表明，五倍子、黃連、烏梅3種藥物的抑菌作用較顯著[23]。在本研究中，分離菌株對氨芐西林、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、慶大霉素等多種藥物有較高的敏感性，其中不乏有禁用藥和限用藥。在嚴(yán)格控制休藥期制度的前提下，選用適宜的抗菌藥物與中草藥聯(lián)用協(xié)同防治大黃魚疾病的發(fā)生具有一定的應(yīng)用前景[25]。

眾所周知，弧菌是海水環(huán)境中的正常菌群，廣泛分布在自然海區(qū)中，通常被認(rèn)為是一種條件致病菌，一般情況下不會引起養(yǎng)殖動物發(fā)病，只有當(dāng)養(yǎng)殖海域環(huán)境條件惡化，引起這些條件致病菌大量繁殖，而養(yǎng)殖動物免疫力低下時才會爆發(fā)弧菌病。因此，以防為主，合理控制養(yǎng)殖密度、改善養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境，適當(dāng)使用免疫增強劑提高魚體的免疫力，才是控制大黃魚弧菌病發(fā)生的關(guān)鍵所在[10-11]。