許 蔚，趙 凱，高巧營(yíng)，宗春輝，高 晟

(1.天津市南開(kāi)醫(yī)院 心內(nèi)一科，天津300100；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津300193；3.天津市南開(kāi)醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津300100)

隨著冠狀動(dòng)脈介入診療技術(shù)的廣泛應(yīng)用和普遍發(fā)展，介入治療逐漸成為冠心病患者主要的治療手段，對(duì)比劑使用頻率的增加促使對(duì)比劑腎病(contrast induced nephropathy，CIN)的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，越來(lái)越受到臨床醫(yī)師的重視。作為三大醫(yī)源性腎損害病因之一，CIN與心血管不良事件的發(fā)生率與病死率增加有關(guān),對(duì)患者的預(yù)后造成嚴(yán)重的影響[1]。一旦發(fā)生CIN，目前尚無(wú)明確的治療手段及藥物,關(guān)鍵以預(yù)防為主。在CIN發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素中，研究表明，糖尿病可作為預(yù)測(cè)CIN的發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，冠心病合并糖尿病患者PCI術(shù)后對(duì)比劑腎病的發(fā)病率顯著升高。

冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌，具有補(bǔ)腎填精、保肺益腎、止血化痰等作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn),其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗細(xì)胞凋亡等作用,尤其在腎保護(hù)方面發(fā)揮重要作用[3]。但目前關(guān)于冬蟲(chóng)夏草預(yù)防CIN發(fā)生的研究尚不多見(jiàn)，且尚無(wú)相關(guān)機(jī)制研究。目前已有大量研究表明，普羅布考能夠有效降低CIN的發(fā)生率及腎損傷程度，且與抗細(xì)胞凋亡有關(guān)[4,5]。本研究通過(guò)建立CIN糖尿病大鼠模型，以普羅布考作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，檢測(cè)藥物冬蟲(chóng)夏草干預(yù)前后糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)，探討冬蟲(chóng)夏草對(duì)糖尿病大鼠CIN的預(yù)防作用及機(jī)制，為臨床用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

100只健康雄性SD大鼠，8周齡，體重240-260 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境所動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)(許可證號(hào) SCXK(軍)2009-003)。鏈脲佐菌素(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，碘克沙醇注射液(GE Health有限公司)，普羅布考(承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，人工冬蟲(chóng)夏草菌粉(杭州中美華東制藥有限公司)。尿素氮( BUN) 、肌酐( Scr) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；NAGL檢測(cè)試劑盒(上海藍(lán)基生物有限公司)，KIM-1檢 測(cè) 試 劑 盒(美國(guó) R&D公司)；Bcl-2 抗體、Bax 抗體、caspase-3抗體(Cell Signaling公司)，蛋白核算測(cè)定儀購(gòu)自Eppendorf AG公司；western Blot電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)于Bio-Rad公司；病理包埋機(jī)、切片機(jī)(LEICA公司)；LEICA DM4000B正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)leica公司。

1.2 模型制備及分組方法

100只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，造模前檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖，均顯示在正常范圍。大鼠禁食 12 h稱重，經(jīng)腹腔按60 mg/kg 劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)，注射72 h及1周后斷尾測(cè)血糖，以非禁食隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。成模大鼠84只，隨機(jī)分為對(duì)照組(N組)，對(duì)比劑腎病組(M組)，冬蟲(chóng)夏草干預(yù)組(C組)，普羅布考干預(yù)組(P組，陽(yáng)性對(duì)照組)4組，每組21只。

1.3 CIN模型建立及取材

根據(jù)高巧營(yíng)[6]報(bào)道的CIN 造模及用藥方法，糖尿病造模后飼養(yǎng) 9 周后，C組給予冬蟲(chóng)夏草劑量(3 g/kg/d) 用雙蒸水配制成濃度 0.2 g/mL的懸液，灌胃處理，P組給予普羅布考 (500 mg/kg) 灌胃，正常對(duì)照組(N組)、對(duì)比劑腎病組(M組)給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù) 6 d; 第 7 天時(shí)禁水不禁食。第8天，經(jīng)尾靜脈注射碘克沙醇注射液(2.0 g iodine/kg)制備CIN模型,以Scr比對(duì)照組升高(>25%)判定CIN的模型是否成功。于注射對(duì)比劑前及注射24 h后，收集尿液。于注射對(duì)比劑前，各組大鼠鼠尾靜脈采血2 ml，離心留取上清液；注射對(duì)比劑24 h后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，開(kāi)腹取下腔靜脈血2 ml，離心留取上清液，采用脲酶法測(cè)定BUN，苦味酸法測(cè)定 Scr。大鼠取血后稱重，開(kāi)腹后采集左右腎臟，留取腎組織。左腎剖開(kāi)部分固定于福爾馬林，以備腎臟病理研究；部分-80℃凍存，用于檢測(cè)指標(biāo)；右腎-80℃凍存，用于Western blotting蛋白定量分析。

1.4 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1腎功能及損傷指標(biāo)檢測(cè)

脲酶法測(cè)定血清尿素氮(BUN)；苦味酸法測(cè)定血清肌酐(Scr)；ELISA 法檢測(cè)尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷因子-1(KIM-1)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用半自動(dòng)生化儀測(cè)定。

1.4.2腎臟組織病理觀察

腎組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片后進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、HE染色，于正置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.4.3腎組織 Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)

提取腎組織總蛋白、SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)、放射自顯影，檢測(cè)腎組織Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組腎功能相關(guān)指標(biāo)比較

對(duì)比劑腎病組(M組)BUN、Scr均高于正常對(duì)照組(N組)(P均<0.01)。普羅布考干預(yù)組(P組)BUN、Scr均低于M組(P均<0.05)；冬蟲(chóng)夏草干預(yù)組(C組)BUN、Scr均低于M組(P均<0.01)。與N組比較，M組大鼠NGAL、KIM-1含量均明顯升高(P均<0.01)；與M組比較，P和C組NGAL含量均明顯減低(P均<0．01)；P組KIM-1含量減低(P<0.05)，C組KIM-1含量減低(P<0.01)。C組與P組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組糖尿病大鼠腎功能指標(biāo)比較

注：BUN:尿素氮；Scr:血肌酐;。NAGL:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；KIM-1:腎損傷因子-1(N組對(duì)照組；M組對(duì)比劑腎病組；P組普羅布考干預(yù)組；C組冬蟲(chóng)夏草干預(yù)組； 與N組比較，*P<0.05,**P<0.01；與M組比較，&P<0.05,&&P<0.01。

2.2 腎臟病理改變

2.2.1各組大鼠HE染色腎小球、腎小管損傷程度檢測(cè)

各組大鼠腎組織的HE染色結(jié)果，N組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)未見(jiàn)病變。M組腎小球基底膜增厚，近曲小管腫脹，胞漿嗜酸性、細(xì)顆粒狀，結(jié)構(gòu)不清，遠(yuǎn)曲小管萎縮，胞漿透明變性。C組及P組兩張病理圖片形態(tài)相似，腎小球基底膜無(wú)明顯增厚，近曲小管及遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較(HE染色,X200)

2.2.2各組大鼠腎小球、腎小管損傷電鏡檢查結(jié)果

N組大鼠腎小球、腎小管細(xì)胞未見(jiàn)明顯損傷；M組大鼠腎小球血管袢基底膜部分性增厚，并有細(xì)密的顆粒物沉積，基膜近系膜側(cè)明顯增厚，部分足突融合。腎小管上皮細(xì)胞包漿可見(jiàn)多量空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹脫顆粒。線粒體嚴(yán)重腫脹，嵴斷裂部分消失。腎小管腔面微絨毛大量脫落，基底膜嚴(yán)重增厚；C組大鼠腎小球血管袢基底膜大部分厚度均勻，有局灶性增厚。大部分血管內(nèi)皮窗孔均勻分布，足突分布均勻，極少量融合； P組大鼠腎小球血管袢基底膜厚度基本均勻，血管內(nèi)皮穿孔分布均勻，足突裂隙均勻分布。腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量溶酶體，部分線粒體排列輕度紊亂，腎小管基底膜厚度基本正常。見(jiàn)圖2。

圖2 腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較(電鏡檢查,X10 000)

2.3 各組腎組織 Bax、Bcl-2 ，caspase-3、caspase-9表達(dá)比較

與正常對(duì)照組(N組)比較，對(duì)比劑腎病組(M組)腎臟Bax、caspase-3表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)及Bcl-2 /Bax均降低(P均<0.05)。與M組比較，C組、P組大鼠Bax、caspase-3表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2 /Bax均升高(P均<0.05) 。C組與P組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05) 。見(jiàn)圖3。

圖3 各組Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

CIN定義為排除其他腎臟損害因素情況下,靜脈或動(dòng)脈內(nèi)使用對(duì)比劑后72 h(3 d) 內(nèi)出現(xiàn)的腎損害：血肌酐較基礎(chǔ)值升高>25%或者絕對(duì)值升高≥44.2 μmol/L[7]。研究顯示，PCI術(shù)后CIN患者住院死亡率高達(dá)22%，其1 年及5 年死亡率為12.1%和44.6%，較非CIN患者明顯升高[8]。糖尿病不僅是冠心病的高危因素，也是CIN發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一[9]；對(duì)CIN進(jìn)行早期診斷和干預(yù)，對(duì)患者的預(yù)后具有十分重要的意義。血肌酐雖作為CIN的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性低，其變化相對(duì)于早期腎損傷較為滯后，且受多種因素的影響；故近年來(lái)的研究表明，NGAL[10]、KIM-1[11]等早期腎損傷標(biāo)記物對(duì)CIN有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值，且與腎損傷程度呈正相關(guān)[12]。

目前，對(duì)CIN的防治措施比較公認(rèn)的是水化治療，尚無(wú)確切藥物，近年來(lái)研究表明，他汀類、普羅布考、前列地爾等藥物能減輕CIN的腎損害程度[13，14]。而中醫(yī)藥治未病的辨證思想為防治CIN提供了新的思路。中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，患者素有正氣不足，感受對(duì)比劑所致的外來(lái)毒邪，進(jìn)一步損傷正氣，產(chǎn)生濕、瘀等病理產(chǎn)物，影響三焦水道通調(diào)，津液失于輸布，發(fā)為CIN，為本虛標(biāo)實(shí)之證[15]。腎為先天之本，氣血陰陽(yáng)之源，肺主宣發(fā)肅降，為一身宗氣之本，對(duì)三焦氣化、水液代謝發(fā)生至關(guān)重要的作用。冬蟲(chóng)夏草性甘溫，歸肺、腎二經(jīng)，可保肺補(bǔ)腎、益氣生津，通調(diào)水道，發(fā)揮腎保護(hù)作用。趙凱[16，17]等研究表明，冬蟲(chóng)夏草制劑可預(yù)防冠心病心絞痛患者CIN的發(fā)生，對(duì)2型糖尿病腎功能不全患者具有改善CIN早期腎損傷的作用,且強(qiáng)化治療更有效。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與對(duì)照組(N組)相比，其余各組的Scr 、BUN 及NGAL、KIM-1數(shù)值均明顯升高；與對(duì)比劑腎病模型組(M組)相比，冬蟲(chóng)夏草干預(yù)組(C組)和普羅布考干預(yù)組組(P組)的Scr 、BUN 及NGAL、KIM-1數(shù)值均明顯下降，說(shuō)明使用對(duì)比劑之前應(yīng)用冬蟲(chóng)夏草干預(yù)具有改善CIN腎損傷的作用，與臨床研究結(jié)果一致。病理結(jié)果亦顯示C組和P組均較M組腎小球腎小管細(xì)胞損傷有所改善。因目前已有大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，普羅布考能夠有效降低CIN的發(fā)生率及腎損傷程度，故本實(shí)驗(yàn)以普羅布考為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草的腎保護(hù)作用與普羅布考相當(dāng)。

對(duì)比劑腎病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與腎血流動(dòng)力學(xué)改變、腎小管上皮細(xì)胞的毒性損害、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、腎小管阻塞等機(jī)制有關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，CIN的發(fā)生與造影劑的直接腎毒性及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，可降低Bcl-2表達(dá)及 Bcl-2/Bax，促進(jìn)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡[19]。在細(xì)胞凋亡家族成員中，Bcl-2蛋白廣泛地定位于細(xì)胞內(nèi)的線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，在凋亡過(guò)程中發(fā)揮著抗凋亡作用，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，故被稱之為“長(zhǎng)壽基因”。線粒體外膜上的抗凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax，在線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放和關(guān)閉過(guò)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。對(duì)比劑可以引起腎小管細(xì)胞的線粒體損傷，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放，從而上調(diào)促凋亡基因 Bax m RNA 的表達(dá)，并下調(diào)抑凋亡基因 Bcl-2 m RNA 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[20]。既往研究表明，普羅布考及冬蟲(chóng)夏草均具有抗細(xì)胞凋亡的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組(N組)比較，對(duì)比劑腎病組(M組)腎臟Bax、caspase-3表達(dá)升高，Bcl-2及Bcl-2 /Bax 表達(dá)降低(P均<0.05)。與對(duì)比劑腎病組(M組)比較，冬蟲(chóng)夏草干預(yù)組(C組)、普羅布考干預(yù)組組(P組)大鼠Bax、caspase-3表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax升高(P均<0.05) 。提示冬蟲(chóng)夏草具有減輕糖尿病CIN大鼠腎細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，冬蟲(chóng)夏草可下調(diào)Bax、caspase-3 表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)及Bcl-2 /Bax，抗細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)CIN的腎保護(hù)作用。