宋麗娜，于 歌，王晶瑩，于珊珊，令狐志宏，謝 風(fēng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，現(xiàn)已被WHO列為需要重點(diǎn)控制的三大類傳染病之一[1-3]。近些年來結(jié)核病的耐藥率不斷升高，耐藥性結(jié)核病已嚴(yán)重威脅人類的健康[4]。因此，對(duì)結(jié)核病進(jìn)行早診斷、早治療、控制傳染源至關(guān)重要[5]。本研究采用T-SPOT.TB和CLEIA兩種方法檢測(cè)疑似結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌的感染情況，并對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討其檢測(cè)的可靠性及對(duì)結(jié)核病診斷的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016 年 6 月至 2017 年 6月期間就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院的疑似結(jié)核病的患者共計(jì)350例，其中最終確診為結(jié)核病的患者共計(jì)127例；最終篩查為非結(jié)核病的患者共計(jì)223例。

1.2 主要試劑

T-SPOT.TB 試劑盒購自英國 Oxford Immunotec 公司；結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒購自鄭州安圖生物。

1.3 方法

1.3.1T-SPOT.TB法檢測(cè)

①采集患者肝素鈉抗凝的全血，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌PBMCs兩次。

②用AIM-V將PBMCs稀釋至終濃度為25萬個(gè)/100 μl 。

③加板：每個(gè)標(biāo)本有 4 個(gè)反應(yīng)孔，分別加入AIM-V 細(xì)胞培養(yǎng)液、抗原A、抗原 B、植物血凝素各50 μl,再分別向 4 個(gè)孔中加入 100 μl稀釋好的細(xì)胞液，放入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-20 h。

④洗滌培養(yǎng)孔，加標(biāo)記二抗(1∶200倍稀釋)，孵育1 h。

⑤洗滌培養(yǎng)孔，加顯色液，6 min后用蒸餾水終止反應(yīng)，待反應(yīng)孔晾干根據(jù)抗原 A 和抗原 B 孔的斑點(diǎn)數(shù)判斷結(jié)果。

1.3.2CLEIA法操作步驟

本實(shí)驗(yàn)使用結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，在安圖全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光酶免疫分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。

①IFN-γ的體外釋放

采集肝素鈉抗凝的全血樣本，混勻，在生物安全柜內(nèi)將其分裝到細(xì)胞培養(yǎng)板相應(yīng)孔內(nèi)(含有陰性對(duì)照培養(yǎng)液N、陽性對(duì)照培養(yǎng)液P、測(cè)試培養(yǎng)液T各100 μl)。培養(yǎng)過夜，吸取培養(yǎng)板孔內(nèi)的上清進(jìn)行IFN-γ檢測(cè)。

② IFN-γ檢測(cè)

在反應(yīng)器中依次加入校準(zhǔn)品(用于定標(biāo))和上清，100 μl/孔。再向反應(yīng)孔內(nèi)分別加入磁微?；鞈乙?0 μl、酶結(jié)合物50 μl，混勻，37℃溫育34 min，洗滌5次，再加入發(fā)光底物A液和B液各50 μl?；靹颍?-5 min檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

③ 結(jié)果計(jì)算

采用參數(shù)擬合的方式，以校準(zhǔn)品的濃度為x軸，發(fā)光對(duì)數(shù)值為y軸繪制反應(yīng)曲線，進(jìn)行樣本的檢測(cè)后系統(tǒng)根據(jù)發(fā)光的數(shù)值自動(dòng)進(jìn)行樣本濃度值的計(jì)算，進(jìn)而判斷檢測(cè)結(jié)果(陰性/陽性)[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包 18.0 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05 表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；P>0.05 提示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 T-SPOT.TB與CLEIA法檢測(cè)的靈敏度和特異性

本試驗(yàn)所選研究對(duì)象共 350 例，確診為活動(dòng)性結(jié)核127例；非結(jié)核患者共223例。結(jié)果顯示，T-SPOT.TB和CLEIA法檢測(cè)的敏感度分別為86.6%、85.0%；特異性分別為91.5%、90.6%(見表1，2)。

2.2 T-SPOT.TB與CLEIA法檢測(cè)的對(duì)比分析

采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包 18.0 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，T-SPOT.TB與CLEIA法檢測(cè)的靈敏度和特異性無顯著差異(P>0.05)。

表1 兩種方法對(duì)活動(dòng)性結(jié)核組的敏感性比較

表2 兩種方法對(duì)非結(jié)核組的特異性比較

在結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)方面，結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法都具有較高的靈敏度、特異性和較高的陰性預(yù)測(cè)值，因此在結(jié)核病的診斷和排除診斷中都具有重要的參考價(jià)值。兩種方法對(duì)臨床的指導(dǎo)意義無顯著差異。

3 討論

本研究分別采用結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析兩種方法對(duì)最終確診為結(jié)核病和非結(jié)核病患者的血液標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，兩種方法都是基于干擾素-γ釋放測(cè)定法(IGRA)的原理，該法已被多個(gè)國家用于潛伏性結(jié)核感染和結(jié)核病的診斷中[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)方面，二者都具有較高的靈敏度和特異性，因此在結(jié)核病的診斷方面都具有較高的臨床價(jià)值。需要注意的是，CLEIA法檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)不確定是否有結(jié)核感染的結(jié)果，在本研究中檢測(cè)到了2例，出現(xiàn)不確定的結(jié)果時(shí)需要臨床醫(yī)生結(jié)合患者的臨床癥狀、體征、影像學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)的結(jié)果綜合判斷。

本研究比較兩種方法的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)二者的檢測(cè)結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此對(duì)臨床的指導(dǎo)意義相同。結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)目前應(yīng)用廣泛，已得到臨床的認(rèn)可和普遍采用[9]；化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)結(jié)核感染尚處于應(yīng)用初期，臨床應(yīng)用尚未普及，但該法利用大型儀器進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，且檢測(cè)成本相對(duì)低廉，若能加以利用也有廣泛的應(yīng)用前景，因此兩種方法各具優(yōu)勢(shì)，在臨床工作中可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇[10]。

本研究僅對(duì)我院診治的部分患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，并不屬于大數(shù)據(jù)的分析，若想得到更具說服力的結(jié)果仍需在今后的工作中繼續(xù)研究，得出對(duì)臨床更有指導(dǎo)價(jià)值的數(shù)據(jù)，更好的為臨床疾病的診治提供參考，為患者的健康服務(wù)。