楊 健，張?zhí)烊A，鮮小萍，李 妍，陳美玲，王 蕊

(陜西省結(jié)核病防治研究所，陜西 西安710048)

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道疾病，目前，我國菌陰肺結(jié)核(3次涂片和1次培養(yǎng)均為陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核)約占所有肺結(jié)核患者的70%[1]，該病的診斷一直困擾著廣大臨床醫(yī)生。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查為結(jié)核病的確診提供了重要病原學(xué)證據(jù)，也是確定傳染性肺結(jié)核尤其是耐多藥肺結(jié)核病的重要依據(jù)[2]。傳統(tǒng)痰涂片染色鏡檢法敏感度較低，培養(yǎng)法耗時(shí)較長，均難以實(shí)現(xiàn)對結(jié)核病患者的早期正確診斷。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通過特異引物與結(jié)核分枝桿菌的gyrB基因結(jié)合，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增[3]，具有特異性高、時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，初步應(yīng)用于全國各級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，我省于2016年引進(jìn)此項(xiàng)技術(shù)用于結(jié)核病的診斷，而目前在我省尚缺乏應(yīng)用LAMP診斷肺結(jié)核病的評價(jià)報(bào)道，筆者采用痰涂片鏡檢法、固體培養(yǎng)法、LAMP同時(shí)對258例研究對象的同一份痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)LAMP對肺結(jié)核病的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月-2018年3月在陜西省結(jié)核病防治研究所和陜西省漢中市第二人民醫(yī)院就診的258例肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對象，根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288—2017)[4]將研究對象分為肺結(jié)核病組和非肺結(jié)核病組。肺結(jié)核病組176例，包括136例臨床確診病例和40例臨床診斷病例；非肺結(jié)核病組82例。

1.2 檢測方法

同時(shí)應(yīng)用痰涂片鏡檢法、固體培養(yǎng)法、LAMP對258例研究對象的同一份痰標(biāo)本進(jìn)行檢測。其中痰涂片采用直接涂片法進(jìn)行金胺O熒光染色，羅氏固體培養(yǎng)采用簡單法，羅氏培養(yǎng)基及染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測采用廣州迪奧生物科技有限公司的儀器和試劑。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作均按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行，如果試驗(yàn)失敗均進(jìn)行二次檢測。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測：在<5 ml痰液中加入1-2倍體積的4%NaOH溶液，渦旋震蕩30秒，室溫靜置15分鐘，使其充分液化，取1 ml液化后痰液至1.5 ml離心管，13 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用1 ml無菌生理鹽水(0.9% NaCl)懸浮，同上離心條件洗滌2次。棄上清液，保留沉淀物。向含沉淀物的離心管中加入40 μl核酸提取液，震蕩混勻，沸水浴(95-100℃)10 min，然后冷卻至室溫；13 000 r/min離心5分鐘，上清液做為模板備用。吸取23 μl聚合酶和20 μl密封液至0.2 ml反應(yīng)管中，依據(jù)所需檢測樣本數(shù)量準(zhǔn)備反應(yīng)體系數(shù)目，每次檢測均設(shè)置陽性對照和陰性對照。將制備的模板以及陰陽性對照加入反應(yīng)體系。將反應(yīng)管置于恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀上進(jìn)行反應(yīng)，由儀器自動(dòng)判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較痰涂片鏡檢法、固體培養(yǎng)法和LAMP檢測MTB的效能；在痰涂片陰性患者中，比較固體培養(yǎng)法和LAMP檢測MTB的效能；在涂陰培陰患者中，評估LAMP檢測MTB的效能。計(jì)算LAMP檢測技術(shù)的敏感度(sensitivity,Se)、特異度(specificity,Sp)。組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各檢測方法與臨床診斷結(jié)果的一致性評價(jià)采用Kappa檢驗(yàn)，K≤0.40時(shí)，兩者一致性較差；0.40

2 結(jié)果

2.1 3種方法對結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率比較

在258例研究對象中，LAMP的陽性檢出率51.55%(133/258)顯著高于痰涂片鏡檢法31.40%(81/258)、固體培養(yǎng)法39.92%(103/258)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.59，P<0.001；χ2=7.03，P=0.01)。在127例黏液痰標(biāo)本中，LAMP的陽性檢出率54.33%(69/127)顯著高于痰涂片鏡檢法40.94%(52/127)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.56，P=0.03)；在唾液痰標(biāo)本中，LAMP的陽性檢出率34.61%(27/78)顯著高于痰涂片鏡檢法12.82%(10/78)和固體培養(yǎng)法19.23%(15/78)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.24，P=0.001；χ2=4.69，P=0.03)；LAMP在唾液痰標(biāo)本中的陽性檢出率34.61%(27/78)顯著低于在干酪痰73.91%(34/46)和黏液痰54.33%(69/127)中的陽性檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.88，P<0.001；χ2=7.54，P=0.01)。見表1。

表1 痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)、LAMP在不同性狀痰標(biāo)本中檢測MTB的結(jié)果比較

2.2 3種方法的檢測效能評價(jià)

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的敏感度73.30%(129/176)顯著高于痰涂片鏡檢法46.02%(81/176)和固體培養(yǎng)法58.52%(103/176)的敏感度，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.98，P<0.001；χ2=8.55，P=0.003)，見表2。

表2 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，三種方法檢測MTB的效能比較

2.2 固體培養(yǎng)法和LAMP 在涂陰患者中檢測MTB的效能比較

在177例涂陰患者中，固體培養(yǎng)法和LAMP的陽性檢出率分別為18.08%(32/177)、30.51%(54/177),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.43,P=0.01)。以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的敏感度52.63%(50/95)顯著高于固體培養(yǎng)法的敏感度33.68%(32/95)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.95，P=0.01)，見表3。

表3 固體培養(yǎng)法和LAMP 在痰涂陰患者中檢測MTB的效能比較

2.3 LAMP 在涂陰培陰患者中檢測MTB的效能評價(jià)

在145例涂陰培陰患者中，LAMP的陽性檢出率為20.00%(29/145)。以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP檢測MTB的敏感度和特異度分別為39.68%(25/63)、95.12%(78/82)，見表4。

表4 LAMP 在涂陰培陰患者中檢測MTB的效能

3 討論

目前，涂片法和培養(yǎng)法依然是大多數(shù)結(jié)核病高發(fā)國家的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的主要病原學(xué)檢測方法，已不能滿足臨床診療的時(shí)效需求，隨著對結(jié)核分枝桿菌全基因組的解析，通過檢測結(jié)核分枝桿菌核酸進(jìn)行快速診斷的技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，LAMP作為一種快速分子檢測方法初步應(yīng)用于我省各級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，這對于提高我省的肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示：LAMP的陽性檢出率(51.55%)明顯高于痰涂片鏡檢法(31.40%)和固體培養(yǎng)法(39.92%)。這與于霞等[6]報(bào)道的研究結(jié)果一致。在唾液痰標(biāo)本中LAMP的陽性率(34.61%)顯著高于痰涂片鏡檢法(12.82%)和固體培養(yǎng)法(19.23%)。涂片法是從形態(tài)學(xué)角度進(jìn)行鑒別，而結(jié)核分枝桿菌因個(gè)體發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等因素影響，存在形態(tài)多樣性，出現(xiàn)球狀、短桿狀、絲狀、細(xì)胞壁缺陷的L型等形態(tài)，痰涂片鏡檢法主要是以典型的桿狀形態(tài)為病原學(xué)報(bào)告依據(jù)的，且主要依賴于檢驗(yàn)人員的識別能力，故可能出現(xiàn)假陰性的情況，敏感度較低。固體培養(yǎng)法在應(yīng)用酸、堿進(jìn)行前處理時(shí)，也會(huì)損傷標(biāo)本中50%-80%的結(jié)核菌活性，降低陽性檢出率[7]。LAMP在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比無需進(jìn)行變性、退火、延伸等復(fù)雜過程，縮短了檢測時(shí)間；同時(shí)減少DNA大片段聚合酶與擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會(huì)，此外，LAMP只有在4條引物完全識別靶序列6個(gè)結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，減少了非特異性的影響。

在唾液痰標(biāo)本中的陽性檢出率(34.61%)顯著低于在干酪痰(73.91%)和黏液痰(54.33%)中的陽性檢出率。唾液痰標(biāo)本并不是從肺深部咳出，含菌量較少，其在玻片上粘附力也較差，在涂片、染色過程中，會(huì)造成待檢成分的大量丟失，導(dǎo)致涂片法、固體培養(yǎng)法檢出率降低，這也提醒醫(yī)務(wù)人員應(yīng)加強(qiáng)對患者的留痰宣教，指導(dǎo)患者留取合格的痰標(biāo)本以提高陽性檢出率。有研究表明LAMP在血痰標(biāo)本中的陽性檢出率低于傳統(tǒng)涂片法和培養(yǎng)法，原因可能與血液成分中含有血紅蛋白等抑制PCR反應(yīng)，造成陽性檢出率降低[8]，本研究在血痰中3種方法陽性檢出率相同，可能由于血痰樣本量較少，僅有7例，無法判別差異。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，LAMP診斷肺結(jié)核病的敏感度(73.30%)顯著高于痰涂片鏡檢法(46.02%)和固體培養(yǎng)法(58.52%)，提示LAMP的臨床應(yīng)用價(jià)值高于痰涂片鏡檢法和固體培養(yǎng)法。本研究LAMP診斷肺結(jié)核病的敏感度(73.30%)高于歐喜超[8]報(bào)道LAMP的敏感度(49.44%)和李金莉[9]報(bào)道LAMP的敏感度(52.7%)，可能由于選擇臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)版本不同所致，本研究依據(jù)2017年的最新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)對患者進(jìn)行診斷分類，與之前的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)相比，肺結(jié)核確診病例條件增加了分子生物學(xué)檢查結(jié)果，故提高了LAMP檢測的敏感度。

近來國內(nèi)多項(xiàng)研究均以固體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)對LAMP進(jìn)行評價(jià)，有研究表明：LAMP對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的檢出限達(dá)到10 CFU/mL[10]，遠(yuǎn)高于痰涂片鏡檢法(5000-10000菌/mL)和固體培養(yǎng)法(100菌/mL)以上的檢出限，在一定程度上說明，涂片和培養(yǎng)均為陰性并不代表痰標(biāo)本中沒有結(jié)核分枝桿菌，是由于細(xì)菌數(shù)量低于檢出限造成的。LAMP對菌陰肺結(jié)核的檢出有可能影響結(jié)果的評判。本研究以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，在涂陰患者中，LAMP的敏感度(52.63%)顯著高于固體培養(yǎng)法的敏感度(32.63%)，LAMP與臨床診斷結(jié)果相比具有中度一致性(Kappa=0.46)；在涂陰培陰患者中，LAMP檢測MTB的敏感度和特異度分別為39.68%、95.12%，與臨床診斷結(jié)果相比一致性較差(Kappa=0.37)；LAMP在涂陰患者中的陽性檢出率為30.51%，在涂陰培陰患者中的陽性檢出率為20.00%，與國內(nèi)報(bào)道[11]LAMP對涂陰或培陰標(biāo)本的陽性檢出率在20%-30%的結(jié)果相一致，以上數(shù)據(jù)提示LAMP對于檢測涂陰肺結(jié)核患者具有一定的技術(shù)優(yōu)勢。

因分子生物學(xué)方法存在一定的假陽性，應(yīng)將LAMP與痰涂片鏡檢法和固體培養(yǎng)法有效聯(lián)合起來，以避免假陽性的發(fā)生，降低誤診率。