李秀文,王運鐸,張毅華

(大連市中心醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連116033)

下呼吸道感染的病原學(xué)診斷指標(biāo)——BLAF、PSB刷出物和痰培養(yǎng)存在各自的方法學(xué)局限?？?、咽部正常菌群和條件致病菌定植的存在，嚴(yán)重降低了痰培養(yǎng)結(jié)果的特異性和診斷價值；BLAF和PSB刷出物培養(yǎng)，雖然避免了非致病菌干擾，但繁瑣而有創(chuàng)的檢查方式，常不被患者接受。為尋求一種合理而有效的下呼吸道感染的診斷方法，為臨床抗感染治療提供依據(jù)，筆者對本院呼吸科292例同步采集的BLAF、PSB刷出物和痰標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果進行比較，分析三者的差異和聯(lián)系，并對下呼吸道常見病原菌耐藥性進行回顧分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源2015年1月-2017年10月我院呼吸內(nèi)科病房，疑似下呼吸道感染患者292例，其中男性191例，女性101例,中位年齡 52歲(18 歲-91歲)。

1.2標(biāo)本采集

1.2.1BLAF 麻醉狀態(tài)下，通過氣管鏡給藥孔少量多次注入37℃注射用生理鹽水，到達病變部位，并負(fù)壓吸引灌洗液和分泌物，每次25-50 ml，共3-4次，總量100-250 ml。保證全程無菌操作，無菌容器收集灌洗液8-10 ml，于30分鐘內(nèi)送檢。

1.2.2PSB刷出物 麻醉狀態(tài)下，纖維支氣管鏡沿鼻腔、喉部、氣管、支氣管通路，到達病變部位，使用保護性防污染毛刷，獲取標(biāo)本，取出后直接點種在血/EMB雙格培養(yǎng)基和沙保羅培養(yǎng)基內(nèi)，30分鐘內(nèi)送檢。

1.2.3痰標(biāo)本 清晨，患者用冷開水漱口，深吸氣后用力咳出呼吸道深部的痰液，直接咳到無菌痰盒里，標(biāo)本量不少于1 ml，2 h內(nèi)送檢。

1.3試劑和方法

1.3.1試劑和儀器 鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的哥倫比亞血/EMB雙格培養(yǎng)基和沙保羅培養(yǎng)基。法國梅里埃公司的VITEK 2細菌鑒定、培養(yǎng)儀和ATB半自動微生物鑒定儀以及相應(yīng)的試劑板條。賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供的英國OXOID頭孢派酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏紙片。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC79603，金黃色葡萄球菌ATCC29213，屎腸球菌ATCC29212。

1.3.2方法 三種標(biāo)本均接種于血/EMB和沙保羅培養(yǎng)基分別進行細菌和真菌培養(yǎng)，細菌于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-20小時,真菌于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版[1]規(guī)定，肺泡灌洗液采用密集劃線法進行計數(shù)培養(yǎng),以菌落數(shù)≥104CFU/ml為陽性，<104CFU/ml為污染；PSB刷出物采用點接種，以培養(yǎng)出致病菌1+以上者為陽性；痰標(biāo)本選取經(jīng)涂片、革蘭染色、鏡檢合格標(biāo)本(上皮細胞<10/低倍視野，白細胞>25/低倍視野)，采用分區(qū)劃線培養(yǎng)，以致病菌生長3+以上者為陽性。對培養(yǎng)陽性的病原菌進行相關(guān)的鑒定和藥敏實驗。藥敏判斷依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2015版及2016,2017版的要求進行。

1.3.3下呼吸道感染的診斷 以參照血象、影像學(xué)支持，除外結(jié)核、病毒、支原體感染、惡性腫瘤等疾病，培養(yǎng)出致病菌并抗菌治療有效為依據(jù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，診斷符合率比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；一致性比較用Kappa檢驗，以Kappa值≥0.90，為一致性非常滿意；Kappa值≥0.75，為比較滿意。細菌及酵母樣真菌的分布及耐藥性特點，使用WHONET5.6軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1診斷符合率受檢的292例患者，確定診斷152例，排除診斷140例，陽性率為52.1%。其中37例患者為兩種以上細菌感染，41例患者為細菌與真菌混合感染。三種標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果與下呼吸道感染診斷的符合率見表1。

表1 三種標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果與下呼吸道感染診斷的符合率(%)

a：與肺泡灌洗液比較，P<0.05

2.2培養(yǎng)結(jié)果的一致性BLAF具有較高的診斷符合率，故以BLAF培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)方法，使用KPSS17.0軟件，計算292例受檢患者PSB刷出物和痰培養(yǎng)結(jié)果的Kappa值，判斷二者與BLAF培養(yǎng)結(jié)果的一致性，具體數(shù)值見表2。

表2 292例患者PSB刷出物及痰與BLAF培養(yǎng)結(jié)果一致性比較

PSB刷出物：一般細菌培養(yǎng)Kappa值=0.9606，真菌培養(yǎng)Kappa值=0.9794；痰：一般細菌培養(yǎng)Kappa值=0.7637，真菌培養(yǎng)Kappa值=0.7931。

2.3BLAF病原菌分布及耐藥性特點BLAF培養(yǎng)的診斷符合率接近金標(biāo)準(zhǔn)，其陽性結(jié)果可直接反映下呼吸道感染的病原菌分布及耐藥特點。本文152例確診患者的BLAF標(biāo)本，共培養(yǎng)出細菌192株，其中革蘭陰性桿菌164株，包括肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、嗜麥芽窄食單胞菌和其它少數(shù)細菌；革蘭陽性球菌28株，主要為金黃色葡萄球菌和D群鏈球菌；共培養(yǎng)出真菌69株，其中酵母樣真菌64株(白假絲酵母47株，熱帶假絲酵母13株、光滑假絲酵母7株和克柔假絲酵母2株)，絲狀真菌5株。BLAF陽性的主要病原菌對常見抗菌藥物的敏感率見表3(絲狀真菌本院尚未開展藥敏實驗，故本文不做耐藥性分析)。

表3 BLAF陽性病原菌對常見抗菌藥物的敏感率(%)

3 討論

臨床對診斷指標(biāo)的準(zhǔn)確性要求日益增高。而接近金標(biāo)準(zhǔn)(組織學(xué)診斷)的BLAF及PSB刷出物培養(yǎng)，因符合下呼吸道感染精準(zhǔn)診斷的要求，已被臨床及實驗室廣泛認(rèn)可[2，3]。但BLAF及PSB刷出物因采集困難、創(chuàng)傷較大、容易交叉感染、難于被患者接受等原因，未能在臨床常規(guī)開展,而痰卻因留取方便，安全無創(chuàng)。因此，準(zhǔn)確定位不同標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果在下呼吸道感染診斷中的價值，對呼吸科患者和臨床醫(yī)生都具有重要的意義。

表1結(jié)果顯示：本院BLAF培養(yǎng)結(jié)果與臨床診斷的符合率略高于PSB刷出物，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)該與BLAF灌洗范圍較大而PSB刷出物為局部采集有關(guān)，而BLAF符合率明顯高于痰，差異有顯著性(P<0.05)，與文獻報道基本一致[4]。本文痰培養(yǎng)的陽性和陰性符合率分別為74.3%和82.9，共檢出假陽細菌27株和真菌26株，主要為鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和酵母樣真菌，這些應(yīng)為本院呼吸科患者口、咽部的定植菌及正常菌群；而未被檢出的51株細菌和34株真菌，主要為非發(fā)酵菌和酵母樣真菌，可能與自然咳痰，深部感染的致病菌未被咳出有關(guān)。表2中Kappa值顯示：無論一般菌還是真菌培養(yǎng)結(jié)果，PSB刷出物與BLAF均具有非常好的一致性(Kappa≥0.90)；而痰與BLAF也具有比較滿意的一致程度(Kappa≥0.75)。作為下呼吸道感染的診斷指標(biāo)，痰培養(yǎng)雖然劣勢明顯，但作為篩查指標(biāo)，它的存在價值卻是不能忽視的。

表3中BLAF培養(yǎng)結(jié)果顯示：本院下呼吸道感染的主要病原菌為革蘭陰性桿菌(62.8%)、酵母樣真菌(26.4%)和革蘭陽性球菌(10.7%)，與相關(guān)報道略有差別[4]。其中肺炎克雷伯菌中ESBL菌株占55.6 %，且包括3株CRE菌株；大腸埃希菌中ESBL菌株占87.5 %；金黃色葡萄球菌中MRSA菌株占50%；真菌中含絲狀真菌5株(煙曲霉菌3株，黃曲霉菌1株，黑曲霉菌1株)。藥敏結(jié)果顯示：產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性較高，較敏感的抗菌素主要為亞胺培南、美羅培南和阿米卡星，而CRE菌株幾乎對所有抗菌素耐藥；非發(fā)酵菌對包括碳青霉烯類多數(shù)抗菌素敏感率偏低，可能與它們復(fù)雜的耐藥機制有關(guān)：如銅綠假單胞菌僅對阿米卡星較敏感，多與其生物膜形成，Ampc酶和MexAB 20prM主動外排泵系統(tǒng)的高水平表達有關(guān)[5]，鮑曼不動桿菌僅對阿米卡星、復(fù)方新諾明、米諾環(huán)素和替加環(huán)素表現(xiàn)出一定的敏感性，可能與其染色體基因突變，外膜孔蛋白改變、主動外排系統(tǒng)、產(chǎn)生滅活酶等原因有關(guān)[6]，嗜麥芽窄食單胞菌因產(chǎn)生金屬酶，能水解碳青霉烯類及廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌素，且不被酶抑制劑抑制[7]，故雖然對左旋氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方新諾明和米諾環(huán)素敏感率保持100%，但可選擇的抗菌素極其有限；金黃色葡萄球菌對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普叮和復(fù)方新諾明的敏感率為100%，對利福平為90%，但對青霉素、紅霉素和克林霉素的敏感率為0%，兩級分化嚴(yán)重，可能與上述藥物在臨床長期廣泛使用有關(guān)；D群鏈球菌僅對萬古霉素、利奈唑胺和奎奴普叮敏感率較高，臨床治療多需要聯(lián)合用藥，值得慶幸的是，本文尚未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VRSA)和腸球菌(VRE)菌株；酵母樣真菌中白假絲酵母菌對五種抗真菌藥物敏感率均為100%，熱帶和光滑假絲酵母菌株對氟康唑和伊曲康唑呈現(xiàn)不同程度的耐藥，而克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥。

綜上所述：BLAF培養(yǎng)對下呼吸道病感染的診斷價值毋庸置疑，但痰培養(yǎng)的篩查價值也不可否定。由于采集方式的局限，現(xiàn)階段前者還難以替代后者，理想的診斷方法應(yīng)為：BLAF與痰培養(yǎng)有機結(jié)合、互相補足。多數(shù)患者可通過痰培養(yǎng)確定或排除診斷，只需對那些多種細菌生長，難以區(qū)分污染菌和病原菌，或患者癥狀消失但痰培養(yǎng)持續(xù)陽性，或多次真菌培養(yǎng)陽性患者，補充培養(yǎng)BLAF，從而快速鎖定致病菌，進行精準(zhǔn)治療。這樣，既能縮小有創(chuàng)檢查的范圍，減輕患者的痛苦，又能提高確診率，避免過度治療。