朱兵帥，朱明武

(1.漯河市中心醫(yī)院 檢驗科，河南 漯河462000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科，河南 衛(wèi)輝453100)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，是導致肝硬化和肝細胞癌的主要危險因素[1]。據WHO統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3%，約2億人感染了HCV，每年新發(fā)病例約3.5萬例，嚴重危害著患者的生命健康，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。據報道，宿主對HCV感染的免疫反應異常是HCV感染的重要發(fā)病機制，細胞因子在丙型肝炎免疫調控和免疫損傷中的作用越來越引起人們的重視[2-4]。Th1細胞分泌TNF-β、IFN-γ、IL-12等細胞因子，可以激活細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，增強機體清除病毒及感染的能力。Th17細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的Th亞群，能分泌重要的炎癥介質，如IL-27、IL-22等。本課題組擬先觀察慢性丙肝患者血清中的IL-12、IL-17、IFN-γ等的表達情況，然后再提取慢性丙肝患者PBMCs，進行IL-21體外刺激，檢測IFN-γ、IL-17蛋白的表達變化，進一步探討IL-21對慢性丙肝患者的免疫調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1研究對象

2016年10月-2017年12月本院就診的HCV-IgG、HCV-RNA均陽性的慢性丙肝患者58例，為病例組，其中男27例，女31例，年齡28-47歲，所有的入圍患者均符合慢性丙肝診斷標準。對照組：無償獻血者50例，其中男25例，女25例，年齡20-54歲，肝炎標記物均為陰性，肝功能正常。隨機從病例組和對照組的研究對象中各選取20例，其中男女各10例，提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。所有研究對象均知情同意，不同分組間的年齡、性別均無顯著性差異。

1.2研究方法

1.2.1血清細胞因子的檢測 所有入圍者空腹采集血液標本3 ml，分離血清，-80℃保存，通過酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)集中檢測IL-12(試劑盒購自上海西唐生物科技公司)、IL-17(試劑盒購自美國R&D公司)、IL-18和IFN-γ(試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)公司)，嚴格按試劑盒說明書進行檢測和分析。

1.2.2PBMCs的提取與培養(yǎng) 采集5 ml肝素抗凝靜脈血，2 h內使用淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque試劑購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司)通過密度梯度離心法分離PBMCs，PBS洗滌2次，以RPMI1640(含有10%小牛血清)調配成2×106/ml的細胞懸液，接種于24 孔培養(yǎng)板，每份標本接種6個孔，每孔1 ml，每孔含有PBMC 1×106個。

1.2.3PBMCs的分組培養(yǎng) 具體的分組情況：①無償獻血者的PBMCs組(正常組)；②IL-21與無償獻血者的PBMCs共培養(yǎng)組(正常+IL-21組)；③慢性丙肝患者的PBMCs組(丙肝組)；④IL-21與慢性丙肝患者的PBMCs共培養(yǎng)組(丙肝+IL-21組)。先在③組和④組的24孔板中加入25 mg/L絲裂霉素，處理1 h后，再把10 μg/L 的IL-21加入到②組和④組的24孔板中。每孔均加入1 mg/L的植物血凝素(PHA)，混勻后于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后收集24孔板中的上清液，通過ELISA法集中檢測IL-17和IFN-γ水平。

2 結果

2.1慢性HCV感染者血液中的Th1/Th17類細胞相關細胞因子的表達情況

與健康獻血者相比，慢性HCV感染者血清IL-12和IFN-γ表達水平明顯降低(P<0.05)，IL-17明顯增高(P<0.01)，IL-18無顯著的變化,見表1。

表1 慢性HCV感染者與對照組血清IL-12、IL-17、IL-18和IFN-γ的比較

注：組間比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.2IL-21對慢性丙肝患者PBMCs分泌IL-17、IFN-γ的調節(jié)情況

IL-21可以調節(jié)PBMCs分泌IL-17、IFN-γ，但影響慢性丙肝患者分泌IL-17效果更明顯，促進PBMCs分泌IL-17水平(約3.5倍)明顯優(yōu)于IFN-γ(約2倍)，見表2。

表2 IL-21誘導不同人群PBMCs分泌IL-17和IFN-γ的情況(pg/mL)

注：與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

HCV 感染后，多數患者可以發(fā)展為慢性丙型肝炎。在HCV慢性化過程中，HCV 可以引發(fā)機體免疫損傷，Th細胞亞群(如Th1/Th2的平衡調節(jié))和細胞因子網絡失衡對慢性丙型肝炎的進展起著重要的作用[5,6]。Th17細胞是不同于Th1/Th2的另一個Th細胞亞群，主要分泌IL-17等細胞因子，可與IL-6、TNF-α、IFN-γ等細胞因子發(fā)揮協(xié)同效應，調節(jié)固有免疫和細胞免疫，促進炎癥的發(fā)生[3,7]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎IL-17水平水平明顯高于正常對照組，說明IL-17在慢性丙型肝炎致病中起著重要作用。對于HCV的免疫治療，既要有效調動體內免疫殺滅病毒，同時也要避免過度免疫反應而損傷自身的正常細胞。

IL-21是一種具有免疫調節(jié)作用的I型細胞因子，主要由CD4+T和活化的NKT細胞分泌，與細胞表面的受體結合后可以分泌細胞因子、炎癥因子和趨化因子等，在病毒免疫和治療中可發(fā)揮重要作用[8]。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HCV、HIV感染者CD8+T細胞殺傷作用減弱，IL-21可增強CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒性，促進Tfh細胞、Th17細胞增殖，負調Treg細胞的免疫抑制作用。Attridge等[10]發(fā)現(xiàn)，IL-21通過激活STAT-3信號通路，上調RORγt的表達，從而使記憶性CD4+T細胞分化為Th17細胞，Th17細胞活化后分泌IL-17等細胞因子，從而導致自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-21刺激正常人群和慢性丙肝患者的PBMCs后，分泌IL-17、IFN-γ水平均增高，但慢性丙肝患者IL-17的增速(約3.5倍)遠高于IFN-γ(約2倍)。IFN-γ主要由活化T細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)產生，具有抗病毒、免疫調節(jié)及抗腫瘤特性。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙肝患者血清IFN-γ水平降低，IL-21刺激PBMCs后，IFN-γ分泌的增速遠不及IL-17。由于IFN-γ主要來源于Th1細胞，IL-17主要來源于Th17細胞，推測IL-21可能也參與了Th1/Th17的平衡調節(jié)，有待于從細胞水平繼續(xù)研究?？傊?，IL-21的存在有助于控制HCV病毒的發(fā)展，降低肝細胞損傷。