石 宇，王宇博,謝 風(fēng)，何成彥，師慶紅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長春130033)

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(zhì)(CSRP)家族是一組由兩個(gè)串聯(lián)排列的LIM結(jié)構(gòu)域與短的富含甘氨酸的區(qū)域相連的蛋白質(zhì)[1]。到目前為止，CSRP家族中的三個(gè)成員(CSRP1，CSRP2和CSRP3)已被證實(shí)在脊椎動物中表征，并且展示了具有獨(dú)特雙重亞細(xì)胞定位的組織特異性分布。其中，CSRP1已經(jīng)在富含平滑肌的各種器官中檢測到高表達(dá)[2]。本研究旨在探討CSRP1在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，研究其差異，探究其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，為臨床診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

遴選吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院近兩年內(nèi)已確診大腸癌患者17例，取新鮮癌組織及距其邊緣10 cm以上的癌旁正常組織標(biāo)本，取材后立即液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

于GE公司(美)購入DTT、SDS、TMED、SDS，于西格瑪公司(美)購入RNA酶、DNA酶、尿素，于Beyo-time公司購入PMSF、考馬斯亮藍(lán)-G250，于Bio-Rad公司購入蛋白質(zhì)定量試劑盒，于賽摩-菲舍爾公司購入LTQ XL離子肼質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1．3．1提取樣本總蛋白，檢測其濃度 打開低溫冰箱取出樣本，將80 mg樣本組織與液氮混合，研磨充分，至其全部粉碎成勻漿。將研磨后樣本以12 000 g離心1 h(溫度 控制在4℃左右)，取離心后上清液體備用?？捡R斯亮藍(lán)染色后，在595 nm下檢測吸光度，確定蛋白濃度。檢測結(jié)束后，將液體分裝，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2水解樣本蛋白，制備多肽混合物 于低溫冰箱中取出樣本，于室溫靜置，待其溫度平衡后，應(yīng)用NH4HCO3稀釋上述樣本以達(dá)到降低尿素濃度的目的。加入適量DTT，充分混勻，確保其最終濃度在20 mmol/L。將制備好的樣本放于56℃避光保存1 h。完成上述操作后，將反應(yīng)溫度調(diào)整至室溫，應(yīng)用適量IAA調(diào)整最終濃度至50 mmol/L，于避光處靜置30 min。加入1∶50固定比例的胰酶：蛋白，37℃水浴過夜。將酶切產(chǎn)物置于-80℃保存。

1．3．3應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定分析多肽混合物 將樣品溶解于Buffer A，每次取出50 μg上樣分析，將制得的多肽放入LTQ XL質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，挑選恰當(dāng)?shù)暮速|(zhì)比檢測區(qū)間，應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。得到的質(zhì)譜圖用Bio-works3.3.1SP1軟件的SEQUEST算法分析處理，用Uniprot-sprot數(shù)據(jù)庫查詢，對差異蛋白進(jìn)行比較。

1．3．4Western Blot分析 將CSRP1作為目標(biāo)蛋白，應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)驗(yàn)證，確定CSRP1蛋白在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況。試驗(yàn)應(yīng)用ABGENT公司(美)采購的CSRP1單克隆抗體，內(nèi)參為β-actin。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對樣本蛋白酶解產(chǎn)物的分析

本試驗(yàn)旨在分析大腸癌組織及癌旁正常組織樣本中同一蛋白質(zhì)的豐度變化，若兩組樣本的譜圖數(shù)比值>1，差值>72，則可認(rèn)為其豐度有差異。遵循上述標(biāo)準(zhǔn)，分析檢測結(jié)果得出大腸癌組織與癌旁正常組織共有44個(gè)差異蛋白，其中21個(gè)蛋白表達(dá)情況為上調(diào)，23個(gè)表達(dá)情況為下調(diào)。本文研究的CSRP1屬于下調(diào)表達(dá)蛋白之一，其質(zhì)譜圖如下(圖1)。

圖1 CSRP1質(zhì)譜圖

2.2 Western Blot驗(yàn)證結(jié)果

Western Blot試驗(yàn)證實(shí)了CSRP1蛋白在大腸癌組織中和癌旁正常組織中的差異表達(dá)，其結(jié)果如下(圖2) 。通過對免疫印跡試驗(yàn)的結(jié)果分析，可以得出CSRP1在癌組織中低表達(dá)，在癌旁正常組織中高表達(dá)的結(jié)論。

3 討論

近年來，大腸癌發(fā)病幾率越來越高。由于起病過程隱匿，患者在疾病早期并無明顯癥狀，確診大腸癌時(shí)已接近中晚期，這不僅加大了疾病的治療難度，同時(shí)也降低了患者的生存率。因此，早診斷、早治療依舊是大腸癌現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)相關(guān)技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)對癌組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況、癌旁正常組織中的對比情況的研究有重要意義[3,4]。通過對比分析某種蛋白在不同組織中的差異表達(dá)，可以為臨床腫瘤的診斷提供新的標(biāo)志物。

圖2 CSRP1免疫印跡圖

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(zhì)1是由兩個(gè)串聯(lián)排列的LIM結(jié)構(gòu)域與短的富含甘氨酸的區(qū)域相連的蛋白質(zhì)，具有連接肌動蛋白束和α-肌動蛋白的作用，同時(shí)可以捆綁肌動蛋白微絲[5]。有研究表明，CSRP1是足體新成份之一，足體具有促進(jìn)ECM(細(xì)胞外基質(zhì))降解的作用，并與細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮是由其細(xì)胞定位決定的，二者息息相關(guān)[6]。研究蛋白質(zhì)在某種細(xì)胞中的定位,并且對比其在某種疾病情況下的定位對臨床診斷意義重大。CSRP1是骨架蛋白之一，已有研究證實(shí)CSRP1在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)較為明顯。除此之外，CSRP1還可以抑制細(xì)胞增殖，當(dāng)應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)凋亡時(shí)，對細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[7]。

CSRP1已被證實(shí)在富含平滑肌的器官中高表達(dá)，其中濃度最高的是前列腺和直腸，大腦、睪丸次之，脾臟和肝臟濃度較低，腎臟最少。此外，有研究證實(shí)，CSRP1與特發(fā)性肺纖維化關(guān)系緊密，可能會增加這類患者肺癌的發(fā)病幾率[8]。在腫瘤組織中，CSRP1同樣存在表達(dá)失調(diào)的情況，例如乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者和低轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者均可將其作為特征標(biāo)志物，前列腺癌、腎癌組織中也出現(xiàn)了CSRP1的表達(dá)失調(diào)[9-12]。

本試驗(yàn)表明，CSRP1在大腸癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，WesternBlot試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了大腸癌組織中CSRP1下調(diào)表達(dá)。該結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。CSRP1在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況差異較大，說明其與腫瘤的發(fā)展及愈后關(guān)系密切，CSRP1的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。