胡穎熹 馮城婷 陶 敏 梁容瑞 趙 晶 李 瑋 史 悅 石鳳靈 李大鵬

蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇蘇州 215000

引言

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一種存在于原核及哺乳類動物體內(nèi)的獨特的DNA損傷修復(fù)酶[1]。MGMT通過接受烷化損傷后DNA的O6位置上的烷基，修復(fù)損傷的鳥嘌呤的活性，保護正常細胞不受烷化劑的致癌作用影響，同時也消除烷化劑對腫瘤細胞的毒性殺傷作用[2-4]。因此，腫瘤細胞中的MGMT高表達可使腫瘤細胞對烷化劑耐藥，而MGMT的低表達可增加正常細胞的致癌風險和腫瘤細胞對烷化劑的敏感性[5]。本實驗擬通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人MGMT干擾質(zhì)粒載體，為MGMT基因的功能研究提供實驗工具。同時探索MGMT的DNA修復(fù)機制，為臨床腫瘤個體化用藥及聯(lián)合用藥提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肝癌細胞株SMMC-7721購自南京凱基生物科技有限公司，內(nèi)切酶（Fermentas）；引物Oligo（Invitrogen合成）；T4 DNA ligase（1U/μl）（EP0061, Fermentas）；凝膠回收試劑盒（AP-GX_250, Axygen）；GeneRuler DNA Ladder（SM0332, Fermentas）；10×Oligo Annealing Buffer（46-8010，Invitrogen）。Trizol Reagent( 15596-026，Invitrogen)；氯仿（AR，國藥）；異丙醇（AR，國藥）；75% 無水乙醇（AR, 國藥）；DEPC H2O（750024，Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase(R250-01, Invitrogen)；熒光染料SYBR Green I（CS7561，Invitrogen）；Rnase Inhibitor（E00381，F(xiàn)ermentas）；oligo dT/Random primer/特異性引物（Oligo，Invitrogen）；Platinum Taq DNA Polymerase（10966034，Invitrogen）；100mM dNTPs（18427013，Invitrogen）；pENTR-U6-shRNA-GFP載體（Invitrogen）；胰酶（sigma）。

1.2 人MGMT基因shRNA干擾序列

根據(jù)hMGMT基因序列，參考既有文獻[3]合成候選靶序列shMGMT1和shMGMT2，2對基因序列如表1。

表1 人MGMT基因RNA干擾序列

1.3 重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

上述合成的每對寡核苷酸各取正義鏈和反義鏈各1 μL，使用T4 DNA ligase分別將退火產(chǎn)物與pENTR-U6-shRNA-GFP載體（圖1）連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，涂布含50 mg/L卡那霉素的LB瓊脂平板篩選轉(zhuǎn)化子，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，利用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒和方法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定大小后送測序。

圖1 pENTR-U6-shRNA-GFP載體結(jié)構(gòu)

1.4 MGMT干擾載體的鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂板過夜培養(yǎng)，從平板上隨機挑選單菌落，通過菌落PCR鑒定。菌落PCR引物：F：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA，R：CGTTACTATGGGAACATACGT。質(zhì)粒成功插入序列后PCR產(chǎn)物應(yīng)為259 bp左右，質(zhì)粒未成功插入序列PCR產(chǎn)物應(yīng)為200 bp左右。挑選PCR擴增鑒定正確的質(zhì)粒載體進行全長測序鑒定。

1.5 細胞培養(yǎng)

使用DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2，95%濕度條件下恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細胞，匯合率達 80%左右時用質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰酶消化、傳代，培養(yǎng)細胞呈單層貼壁生長。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

選擇細胞狀態(tài)良好的SMMC-7721細胞，制成細胞懸液，接種至24孔板中。37℃培養(yǎng)過夜，使細胞融合至80%密度。轉(zhuǎn)染前，更換為無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。溶液A配制：吸取0.8μg質(zhì)粒加入到50μL的Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻。溶液B配制:吸取2μL lip2000加入到50μL的Opti-MEME培養(yǎng)基，室溫靜置5min。溶液A與溶液B混勻，室溫靜止20min。加入到細胞中。轉(zhuǎn)染4～6h后，更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察，相同視野下計數(shù)綠色熒光細胞數(shù)與自然光下總細胞數(shù)百分比，取其平均值作為轉(zhuǎn)染效率。

1.7 hMGMT shRNA干擾效率驗證

1.7.1 Realtime-PCR檢測hMGMT shRNA干擾效果用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染后細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase(R250-01, Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green法用hMGMT引物和β-actin引物進行分管Realtime-PCR擴增，QPCR反應(yīng)條件如下：

95 ℃ 2 min ；

（95 ℃ 10 secs，60 ℃ 30 secs，70 ℃ 45 secs）*40 循環(huán) ；

72 ℃ 10mins。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析肝癌細胞中MGMT的mRNA水平。所用兩對引物如表2。

表2 人肝癌細胞MGMT基因及人β-actin基因引物序列

1.7.2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后MGMT蛋白的表達 將轉(zhuǎn)染后的SMMC-7721肝癌細胞分別加入1 mL RIPA及1 uL蛋白酶抑制劑，4℃下15 000 g離心5 min，離心收集上清液，BCA法檢測蛋白質(zhì)含量。按1:4比例加上樣緩沖液。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，330 mA，20 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉3 h，依次加入1:1000稀釋的鼠抗人MGMT、β-Actin一抗4℃孵育過夜，l：5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3遍，TBS洗膜第四遍，加1 mL發(fā)光液，暗室曝光。

1.8 統(tǒng)計學分析

采集數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，shRNA1和shRNA2陽性菌檢產(chǎn)物可在200bp和300bp間見到一條特異性條帶，而且無其他非特異性擴增帶。根據(jù)PCR電泳結(jié)果（圖2，本次選取的克隆編號分別為1-5、2-3，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒分別命名為pENTR-U6-iMGMT1-5、pENTRU6-iMGMT2-3。

圖2 PCR菌檢電泳圖譜

2.2 shRNA重組載體的測序鑒定

經(jīng)基因測序驗證，MGMT基因的RNAi質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計序列完全一致（見圖3、圖4）。

圖3 pENTR-U6-iMGMT1-5測序結(jié)果

圖4 pENTR-U6-iMGMT2-3測序結(jié)果

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將重組質(zhì)粒pENTR-U6-iMGMT1-5，pENTR-U6-iMGMT2-3及空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細胞，相應(yīng)分為iMGMT1組、iMGMT2組以及NC組。轉(zhuǎn)染48h后進行熒光顯微觀察。熒光下，iMGMT1組、iMGMT2組及NC組均出現(xiàn)綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染的SMMC-7721無綠色熒光，表示質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染入SMMC-7721肝癌細胞中，如圖5。

圖5 各組SMMC-7721細胞48小時后的綠色熒光和光鏡照片

2.4 干擾載體對肝癌細胞MGMT基因表達的影響

Realtime PCR法以β-actin為內(nèi)參檢測轉(zhuǎn)染48小時后各組肝癌細胞中MGMT mRNA的相對表達量，計算得出shRNA1組和shRNA2組干擾效率依次為(56.4±0.75)%，(63.5±1.34)%，表明shRNA1組和shRNA2組與NC組合和KB組相比，MGMT基因mRNA量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），如圖 6。

圖6 各組肝癌細胞MGMT mRNA的相對表達量

提取轉(zhuǎn)染48 h后的六孔板每孔細胞總蛋白。用抗MGMT抗體進行Western blot和化學發(fā)光顯色（圖7）可見，RNAi后和KB、NC組相比MGMT的蛋白表達水平明顯下降， shRNA2組蛋白表達下降最明顯。

圖7 各組肝癌細胞MGMT 蛋白表達

3 討論

人MGMT基因是一種特異性針對烷化劑引起的損傷進行修復(fù)的DNA修復(fù)基因，位于人常染色體10q26.3，分子量為170kd，編碼含207個氨基酸的蛋白質(zhì)，其第四外顯子中的半胱氨酸殘基為烷基受體，為蛋白酶的活化位點[6]。MGMT在腫瘤產(chǎn)生和腫瘤預(yù)防中都有著重要的意義，許多化療藥物攻擊DNA的O6位置上的鳥嘌呤，從而達到損傷DNA的效果，MGMT將烷基從烷基化的鳥嘌呤上轉(zhuǎn)移到一個半胱氨酸殘基上，這個過程是發(fā)生在MGMT內(nèi)的，導(dǎo)致了DNA結(jié)構(gòu)上受損的鳥嘌呤部分恢復(fù)，并伴隨產(chǎn)生不可逆的MGMT自身泛素化和滅活[7-11]?，F(xiàn)已有研究證實在人類細胞系、異種移植物模型及MGMT轉(zhuǎn)基因小鼠中，MGMT可對抗烷化劑的細胞毒性作用，起到保護細胞的作用[12-13]。轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗數(shù)據(jù)表明，較高水平的MGMT表達顯著地保護特定的靶細胞不受烷基化的N-亞硝基化合物致癌作用的影響，且轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的MGMT表達具有組織特異性[14]。肝臟在所有人類腫瘤中有著最高的MGMT活性[15]。烷化劑類細胞毒藥物通過與細胞內(nèi)DNA共價結(jié)合發(fā)生烷化反應(yīng)而誘導(dǎo)細胞死亡，是臨床上應(yīng)用較廣泛的抗腫瘤藥物，其治療效果受DNA修復(fù)蛋白功能的影響。Baer等人研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的高水平MGMT與烷化劑耐藥有關(guān)[16]。因此MGMT啟動子甲基化水平的檢測可以輔助烷化劑耐藥患者的合理用藥，同時這類患者可合并MGMT抑制劑實現(xiàn)合并用藥，從而提高臨床腫瘤化療效果[17]。截至目前為止，MGMT與化療的關(guān)系及其耐藥機制大多是在腦膠質(zhì)瘤中探討的，且已有文獻證實在缺乏MGMT表達的惡性腦腫瘤中，使用烷化劑全身化療是有效的，并且可以改善預(yù)后[18]。但是，至今未有文獻證明MGMT與肝癌的耐藥是否相關(guān)及其具體機制為何。既有文獻以及前期的實驗結(jié)果提示較高水平的MGMT表達可能是導(dǎo)致肝癌細胞對很多烷化作用藥物耐藥的原因，但仍需更多研究對其加以驗證。

本實驗通過RNAi構(gòu)建肝癌細胞MGMT干擾質(zhì)粒載體，抑制肝癌細胞中MGMT的表達。結(jié)果顯示所構(gòu)建的兩個質(zhì)粒均十分有效地抑制了肝癌細胞中MGMT的表達，對后續(xù)研究烷化作用類藥物對肝癌細胞的殺傷作用提供了一個有效的工具，為從 DNA 損傷修復(fù)途徑促進化療藥物抗肝癌作用提供新的思路。