高婷　袁芳艷　劉澤文

摘要：從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場(chǎng)具有嚴(yán)重呼吸道癥狀的疑似病例中，通過(guò)臨床解剖采集豬的腦組織、肺組織、扁桃體組織、關(guān)節(jié)液等病料進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察、PCR鑒定及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離到的一株細(xì)菌為豬鏈球菌，經(jīng)PCR分型鑒定結(jié)果為2型豬鏈球菌，藥敏試驗(yàn)顯示，該菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林高度敏感，為豬場(chǎng)用藥提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；分離；鑒定；耐藥性

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2018）10-0005-02

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患傳染病的病原菌，其不僅可以感染豬導(dǎo)致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及心內(nèi)膜炎等，引起斷奶仔豬或育肥豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，還可以感染人導(dǎo)致敗血癥型休克甚至死亡，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康和生命安全[1，2]。本研究對(duì)湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場(chǎng)采集了疑似病豬的腦、肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液等病料，進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定，通過(guò)分型及藥敏試驗(yàn)，初步了解了該豬場(chǎng)鏈球菌病發(fā)病情況，篩選出了高敏感藥物，為豬場(chǎng)臨床用藥選擇以及接種與血清型相符的疫苗進(jìn)行預(yù)防提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場(chǎng)采集發(fā)病豬的腦、肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液等病料。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）購(gòu)自Difco公司；革蘭氏染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；無(wú)菌脫纖綿羊血均購(gòu)自南京茂捷微生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；2×Taq mix、2 000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配置

TSA固體培養(yǎng)基：取TSA培養(yǎng)基粉末4 g，溶于100 mL超純水中，115 ℃滅菌15 min，冷卻至50 ℃加新生牛血清10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ矫螅篢SA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃加無(wú)菌脫纖綿羊血10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存?zhèn)溆肹3]。

1.4 細(xì)菌分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采取豬病料均勻涂布于血平皿培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h后，挑選可疑單個(gè)鏈球菌菌落純化，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.4.2 鏡檢 挑取TSA平板上的單菌落，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的顏色和形態(tài)[4]。

1.4.3 生化鑒定 挑取TSA平板上的單菌落，搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將菌液接種乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖等生化鑒定管，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.4.4 PCR分型 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)豬鏈球菌與豬鏈球菌2型特異性引物[5，6]，用于豬鏈球菌的鑒定和分型，引物序列見(jiàn)表1。挑取疑似SS并純化的單菌落裂解，作為PCR擴(kuò)增的模板，空白對(duì)照用等體積的去離子水代替模板，陽(yáng)性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)室保存的2型豬鏈球菌。

1.5 藥敏試驗(yàn)

將分離純化的菌株按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的形態(tài)特征

分離到的細(xì)菌在加血清的TSA上菌落呈半透明、光滑、圓形突起的細(xì)小菌落，順著光線看去菌落泛著藍(lán)光。在血平板上可見(jiàn)生長(zhǎng)均一的細(xì)菌，菌落周?chē)笑寥苎h(huán)。革蘭氏染色為革蘭氏陽(yáng)性菌，卵圓形，鏈狀，鏈的長(zhǎng)短由2～5個(gè)球菌組成。

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示，分離的疑似菌脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、M-R 試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)均為陰性；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、棉實(shí)糖、七葉苷、水楊苷等碳水化合物；不發(fā)酵木糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、菊糖；符合豬鏈球菌的生化特征。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，用豬鏈球菌特異性基因16srRNA的引物能擴(kuò)出目的條帶，標(biāo)準(zhǔn)豬鏈球菌和分離株均在1 066 bp處（圖2）；用2型豬鏈球菌特異性基因cps2J的引物能擴(kuò)出目的條帶，標(biāo)準(zhǔn)豬鏈球菌和分離株均在557 bp處（圖2），與預(yù)期片段一致，測(cè)序與豬鏈球菌SC19序列一致，證明所分離菌株為2型豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離的2型豬鏈球菌進(jìn)行了14種抗菌藥物的耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟等產(chǎn)生耐藥性，對(duì)環(huán)丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感（表2），臨床上可用該藥對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行治療。

3 討論

根據(jù)莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為33個(gè)血清型[7，8]，其中2型是毒力最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)血清型[2，5，7，9，10]，其不僅可以感染豬導(dǎo)致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及心內(nèi)膜炎等，引起斷奶仔豬或者育肥豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，還可以感染人導(dǎo)致敗血癥型休克甚至死亡，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康和生命安全[1]。本研究從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場(chǎng)分離出一株細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色確定為革蘭氏陽(yáng)性菌，隨后采用生化鑒定方法和PCR技術(shù)，證實(shí)該菌為2型豬鏈球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，2型豬鏈菌對(duì)強(qiáng)力霉素、卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟產(chǎn)生耐藥性，對(duì)環(huán)丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感。臨床上，建議采用藥敏試驗(yàn)篩選出高敏感藥物進(jìn)行治療，可很大程度上改善病情，并建議在生產(chǎn)實(shí)踐中注射含有2型豬鏈球菌的多價(jià)疫苗，以期更好地預(yù)防豬鏈球菌病的發(fā)生和流行。

參考文獻(xiàn)：

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