張 賀 勾榮彬 牛含虛 孫曉紅 徐群淵 段德義

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院 北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGFs)在腦的正常生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用，通過(guò)Ras-MAPKs(Erk1, 2和p38)和PI-3K/Akt對(duì)胚胎腦的神經(jīng)干細(xì)胞和成熟神經(jīng)元以及成年腦的神經(jīng)發(fā)生、軸突重塑和新突觸形成發(fā)揮多種效應(yīng)[1-2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGF binding proteins, IGFBPs)通過(guò)阻礙IGFs與其受體的結(jié)合而抑制IGF的生物學(xué)作用，但在某些條件下，則可以增強(qiáng)IGF的作用[3]。此外，IGFBP具有IGF非依賴性作用(IGF-independent action)，如IGFBP4通過(guò)抑制β-catenin信號(hào)通路可以保護(hù)缺血損傷的心肌[4]和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞發(fā)育[5]。

IGFBPs在腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]：如IGFBP1～3, 6導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦生長(zhǎng)減緩或IGFBP5導(dǎo)致相對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)較快，IGFBP3導(dǎo)致細(xì)胞增生減少，IGFBP1導(dǎo)致神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘形成減少，IGFBP6導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞減少，但I(xiàn)GFBP4對(duì)腦內(nèi)細(xì)胞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響迄今報(bào)道不多。本研究室構(gòu)建了神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子血小板源性生長(zhǎng)因子-β(platelet derived growth factor-β, PDGF-β)驅(qū)動(dòng)的IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)成年小鼠IGFBP4在腦內(nèi)的分布符合PDGF-β啟動(dòng)子調(diào)控的外源基因在胚胎和成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)部位，動(dòng)物體質(zhì)量未見(jiàn)明顯改變但整腦質(zhì)量增加了8.4%[6-7]。

本研究進(jìn)一步明確了IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠腦質(zhì)量增加究竟屬于神經(jīng)元和(或)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增多以及IGFBP4激活了胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ型受體(insulin-like growth factor-Ⅰ receptor， IGF-IR)信號(hào)通路，還是通過(guò)IGF非依賴性作用如調(diào)控β-catenin而調(diào)控腦細(xì)胞發(fā)育。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)IGFBP4轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0007]，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF 級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在24 ℃左右，相對(duì)濕度45% ～ 65%，自動(dòng)光控，自由進(jìn)食和飲水。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可(倫理編號(hào)：AEEI-2017-029)，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化法分別觀察轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mouse, TG)和野生型小鼠(wildtype mouse，WT)腦內(nèi)細(xì)胞分化能力、信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)以及小鼠運(yùn)動(dòng)情況。

1.1.2 主要試劑

鼠尾基因組DNA提取試劑盒(CW2094S)和PCR 擴(kuò)增相關(guān)試劑(CW0682M)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成；實(shí)體組織和細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒(23227)購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜(IPVH00010)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司；髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein， MBP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司(10458-1-AP)；小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自北京冠星宇科技有限公司；兔抗IGFBP4抗體(NBP1-80549)購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；兔抗NeuN抗體(ab177487)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔源性的Erk1, 2、p-Erk1, 2、p38、p-p38、Akt、p-Akt、Bcl-2、Caspase-3和β-catenin等分子抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(E030120)和HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(E030110)購(gòu)自美國(guó)Earthox公司。ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；X線膠片購(gòu)自銳珂醫(yī)療公司。

1.2 方法

1.2.1 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

剪取小鼠尾或耳緣組織提取鼠基因組DNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)重組IGFBP4表達(dá)框在小鼠基因組的整合。上游引物：5′-GGCCAGATTCATGGACTG-3′(PDGF-β啟動(dòng)子的第1 190～1 208 bp)，下游引物：5′-AGCTTCTCCTCGGAGCAAG-3′(IGFBP4編碼序列的第86～104 bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度472 bp。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：95 ℃變性60 s，60 ℃退火30 s，和72 ℃延伸60 s，最后72 ℃延伸10 min。1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.2 檢測(cè)海馬少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

用Isotropic Fractionator細(xì)胞計(jì)數(shù)法[8]分析海馬少突膠質(zhì)前體細(xì)胞比例。生后28 d(postnatal day 28，P28)小鼠用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛進(jìn)行灌注固定，取海馬組織勻漿獲得細(xì)胞核懸液，加入少突膠質(zhì)前體細(xì)胞核的標(biāo)志物Olig2抗體孵育，離心加入FITC綠色熒光標(biāo)記二抗孵育。用流式細(xì)胞儀分析至少5 000個(gè)DAPI復(fù)染的細(xì)胞核中Olig2陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.3 Western blotting法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

P28轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠各3只，12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠6只，野生型小鼠5只，提取小鼠嗅球、皮質(zhì)、海馬、小腦和腦干蛋白，用BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)定量分析后每份樣品取10g進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠[5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃縮膠和12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的分離膠]電泳(濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V)，然后轉(zhuǎn)至 PVDF膜上(膜4.5 cm×8 cm，45 mA，45 min)。10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h后，分別用下列一抗4 ℃孵育過(guò)夜：β-actin抗體(1∶2 000)，GFAP抗體(1∶2 000)，IGFBP4抗體(1∶1 000)，NeuN抗體(1∶1 000)，Erk1, 2(1∶1 000)，p-Erk1, 2(1∶1 000)，p38(1∶1 000)，p-p38抗體(1∶1 000)，Akt抗體(1∶1 000)，p-Akt(1∶1 000)，Bcl-2抗體(1∶1 000)，Caspase-3抗體(1∶1 000)，β-catenin抗體(1∶1 000)。HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗體(均1∶5 000) 室溫孵育1 h，ECL超敏發(fā)光液孵育3 min，經(jīng)X線膠片曝光顯影，再用多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem Q，美國(guó)ProteinSimple公司)掃描待測(cè)蛋白條帶。用Image J 1.49版軟件分析待測(cè)蛋白條帶灰度與作為內(nèi)參的β-actin或磷酸化蛋白條帶灰度的比值，作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Rotarod實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物行為學(xué)

小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(Rotarod test)可以檢測(cè)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性和平衡能力[9]。首先在Rotarod(LE8205，Harvard Apparatus)分別訓(xùn)練2.5月和12月齡動(dòng)物以適應(yīng)轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)。第1天上午和下午在恒速模式下(4轉(zhuǎn)/min和8轉(zhuǎn)/min)分別訓(xùn)練小鼠運(yùn)動(dòng)5 min，多次練習(xí)不能達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的小鼠淘汰掉。第2天繼續(xù)恒速訓(xùn)練(16轉(zhuǎn)/min)小鼠運(yùn)動(dòng)5 min(不必淘汰)。第3天進(jìn)行兩次模擬計(jì)時(shí)測(cè)試，在加速模式下(最大至40轉(zhuǎn)/min)訓(xùn)練5 min，測(cè)量小鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落時(shí)間。第4天正式測(cè)試，方法同模擬測(cè)試，測(cè)量小鼠掉落時(shí)間，共3次取平均值，兩次實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間大于1 h以避免小鼠過(guò)于疲勞。模擬測(cè)試與正式測(cè)試均需要在安靜避光環(huán)境下進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠表型的鑒定

獲得C57BL/6J轉(zhuǎn)基因首建鼠5只，其中1只動(dòng)物因?yàn)橥庠碊NA的插入毛色呈黑褐色，其余為黑色(圖1A)。DNA測(cè)序證實(shí)PDGF-β啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的mRNA第一個(gè)起始密碼子ATG即為IGFBP4蛋白的翻譯起始位點(diǎn)(圖1B)。Western blotting分析表明P28轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)海馬(圖1C)和腦干(圖1D)組織中的IGFBP4表達(dá)相對(duì)野生型小鼠(WT)有不同程度的增加。

圖1 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定Fig.1 Identification of IGFBP4 transgenic mouseA：Transgenic mice are black or black-brown; B：PDGF-β promoter initiated correct transcription and translation of recombinant IGFBP4; C：IGFBP4 expression in P28 mouse hippocampus; D：IGFBP4 expression in P28 mouse brain stem; *P<0.05 vs WT;IGFBP4：insulin-like growth factor binding protein 4；PDGF-β：platelet derived growth factor-β；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

2.2 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化

用Isotropic Fractionator并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(圖2A,2B)分析表明P28轉(zhuǎn)基因小鼠海馬少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(Olig 2+)數(shù)量明顯增多(圖2C)。神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物NeuN(圖2D)和GFAP(圖2E)表達(dá)改變不明顯，少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物MBP表達(dá)明顯升高(圖2F)。

2.3 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠海馬IGF-IR通路的激活情況

P28小鼠海馬組織IGF-IR通路的激活情況半定量檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Ras-Raf-MAPK通路的p38磷酸化改變不明顯(圖3A)，而Erk1, 2(圖3B)和PI3K-Akt通路的Ak(圖3C)這兩種蛋白的磷酸化明顯升高。

2.4 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞的存活能力

P28轉(zhuǎn)基因小鼠海馬β-catenin(圖4A)和Bcl-2(圖4B)的表達(dá)改變不明顯，而Caspase-3的表達(dá)下降(圖4C)。

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化Fig.2 Neuronal and glial differentiation in the hippocampus of the transgenic miceA：single parameter histogram of flow cytometric analysis of Olig 2+cells in WT mouse; B：single parameter histogram of flow cytometric analysis of Olig2+cells in TG mice; C：isotropic Fractionator analysis for the number of oligodendrocyte precursors; D：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN; E：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of GFAP; F：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of MBP; *P<0.05 vs WT; WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse; MBP：myelin basic protein;GFAP:glial fibrillary acidic protein.

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬MAPK和Akt通路的激活Fig.3 Activation of MAPK and Akt in the hippocampus of the transgenic miceA：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-p38; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-Erk1, 2; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-Akt; *P<0.05 vs WT；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞的存活Fig.4 Survival of cells in the hippocampus of the transgenic miceA：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of β-catenin; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of Bcl-2; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of Caspase-3; *P<0.05 vs WT； WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

2.5 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)能力

2.5月和12月齡小鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)之間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與是否轉(zhuǎn)IGFBP4基因沒(méi)有交互作用，而TG和WT小鼠間的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12月齡動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖5A)。12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠小腦神經(jīng)元NeuN(圖5B)以及皮質(zhì)神經(jīng)元NeuN(圖5C)和少突膠質(zhì)細(xì)胞MBP(圖5D)的表達(dá)均有增加(P<0.05)。

3 討論

利用本研究室自建的神經(jīng)元過(guò)表達(dá)IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)幼年動(dòng)物腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞改變不明顯，Erk1, 2和Akt磷酸化升高，Caspase-3表達(dá)下調(diào)，而β-catenin和Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯改變，12月齡的成年動(dòng)物小腦和海馬神經(jīng)元有增多趨勢(shì)，其在Rotarod的運(yùn)動(dòng)能力也明顯增強(qiáng)。筆者用Isotropic Fractionator結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)腦組織少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligo2標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞核)進(jìn)行計(jì)數(shù)。沒(méi)有找到理想的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞核標(biāo)志物；而MBP標(biāo)記成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘，也不能用免疫組織化學(xué)法及體視學(xué)作少突膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，因此用Western blotting來(lái)半定量分析MBP的表達(dá)水平。

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞分化情況Fig.5 Rotarod performance of the transgenic mouse and neural differentiationA：improvement of rotarod performance at postnatal months 2.5 and 12; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN in the cerebellum; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN in the cortex; D：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of MBP in the cortex; *P<0.05 vs WT；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse; MBP：myelin basic protein.

IGFs在腦的正常生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用[1]，在神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)表達(dá)IGF-I，能促進(jìn)成年轉(zhuǎn)基因小鼠膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分化[10]，其神經(jīng)效應(yīng)主要是通過(guò)IGF-IR的Ras-Raf-MAPK和PI3K/Akt通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的[2]。IGFBPs則通過(guò)調(diào)節(jié)IGFs與其受體的結(jié)合而抑制或增強(qiáng)IGF的作用(即IGF依賴性機(jī)制)或通過(guò)IGF非依賴性機(jī)制如調(diào)控Wnt/β-catenin經(jīng)典通路起作用[3]。Wnt經(jīng)典通路激活促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增生和分化[11-12]。本研究顯示 IGFBP4轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠海馬組織的β-catenin蛋白水平?jīng)]有發(fā)生明顯改變，說(shuō)明IGF非依賴性機(jī)制(Wnt/β-catenin經(jīng)典通路)可能沒(méi)有參與IGFBP4對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)控。轉(zhuǎn)基因小鼠腦Erk1, 2和Akt的磷酸化升高，支持IGFBP4主要是通過(guò)IGF-IR通路調(diào)控腦內(nèi)細(xì)胞的分化。與轉(zhuǎn)基因小鼠腦Akt和Erk1,2磷酸化增高不同，本課題組體外實(shí)驗(yàn)顯示：IGFBP4抑制小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞增生、降低Akt磷酸化但未明顯改變Erk1,2磷酸化，并促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化[13]，但沒(méi)有觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞Akt和Erk1,2的磷酸化。筆者將繼續(xù)觀察神經(jīng)前體細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后Akt和Erk1,2磷酸化的改變，這將有助于厘清體內(nèi)外Akt和Erk1,2不同激活的意義。

Akt激酶的磷酸化則通過(guò)上調(diào)Bcl-2等抗凋亡分子或降低Caspase-3/9和Bad/Bax等凋亡分子的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活[2]。Erk1, 2的激活(磷酸化)參與了少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化和成熟[2]。本課題組構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠IGFBP4過(guò)表達(dá)主要在神經(jīng)元，據(jù)此推測(cè)：神經(jīng)元合成的IGFBP4蛋白分泌至胞外主要影響了神經(jīng)元軸突的髓鞘細(xì)胞少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，通過(guò)激活I(lǐng)GF-IR通路的Erk1, 2促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成。但是，Erk1, 2分子激活與轉(zhuǎn)基因小鼠海馬少突膠質(zhì)細(xì)胞分化是上下游關(guān)系還是平行變化，將在體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)阻斷這些信號(hào)分子再觀察細(xì)胞分化改變來(lái)判斷。出生28 d小鼠腦神經(jīng)元改變不明顯，但12月齡小鼠小腦和皮質(zhì)神經(jīng)元NeuN的表達(dá)以及皮質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞MBP均有增多，這可能與Akt磷酸化升高，Caspase-3表達(dá)下調(diào)提高神經(jīng)元存活能力有關(guān)。小腦結(jié)構(gòu)缺陷會(huì)造成動(dòng)物在Rotarod的運(yùn)動(dòng)能力減弱[9]。因此，12月齡小鼠小腦和皮層神經(jīng)元NeuN表達(dá)增高可能可以解釋小鼠在Rotarod的運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。

筆者觀察到的IGFBP4在腦內(nèi)的作用與已報(bào)道[2]的其他IGFBP分子的作用不同：IGFBP1, 2, 3, 5, 6過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元數(shù)量減少。因此，本研究結(jié)果為運(yùn)用神經(jīng)干細(xì)胞再生治療臨床前和臨床應(yīng)用研究修復(fù)腦損傷提供新思路。