呂霞麗 李自慧 潘麗萍 賈紅彥 張宗德 劉 洋

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149)

結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，嚴(yán)重威脅著人類的健康，切斷結(jié)核分枝桿菌傳播途徑是控制結(jié)核病傳播的重要措施之一。目前常用的結(jié)核分枝桿菌消毒劑有含碘類、含氯類、含醛類、過氧化物類等。這些消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌都有一定的殺滅作用但也均存在不同的不良反應(yīng)。如含碘類消毒劑會(huì)導(dǎo)致過敏[1]，甚至?xí)鸺谞钕偌膊2]等嚴(yán)重后果。含氯類消毒劑對(duì)人體皮膚黏膜造成損害，如高濃度的84消毒液(次氯酸鈉)可致使皮膚發(fā)白、水腫發(fā)炎、水皰，致使眼部疼痛、流淚、潰瘍等[3]；84消毒液對(duì)操作臺(tái)面和金屬器械存在腐蝕性[4]。含醛類消毒劑有強(qiáng)刺激性、毒性和腐蝕性，甚至能引起過敏和哮喘[5]。過氧化物類消毒劑易分解、刺激性強(qiáng)，可引起DNA損傷、基因突變、致癌等[6]。因此，迫切需要更為安全有效的消毒劑切斷結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)散傳播。

乙酰丙酸-十二烷基硫酸鈉(levulinic acid，sodium dodecyl sulfate，LVA-SDS)是一種廣譜的，殺滅作用較強(qiáng)的新型消毒劑[7-8]。LVA主要生產(chǎn)原料是含纖維素的可再生原料(比如高粱[9]等)，因此不僅成本低、產(chǎn)量高，而且無害無污染。經(jīng)過美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證和批準(zhǔn)[10]，LVA可以加入到化妝品、調(diào)味劑、煙草等食品或者日常用品中，具有很好的安全性。SDS也是FDA認(rèn)證的多功能添加劑，是一種活性添加劑，已經(jīng)廣泛用于日常生活中，比如添加到蛋清、果汁、植物油和明膠中等[11]，其安全性也得到了認(rèn)可?？梢奓VA-SDS確實(shí)具有安全性好等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)大腸桿菌、沙門菌、人類諾瓦克病毒等多種微生物均有較好的殺滅作用，但國(guó)內(nèi)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用的研究報(bào)道較少。因此，本研究將LVA和SDS簡(jiǎn)單混合后，初步探討對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用，并對(duì)其在實(shí)際應(yīng)用時(shí)的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1)菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC_27294)，耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼耐藥，臨床藥敏編號(hào)2202)，均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室菌株庫。

2)消毒劑：純度98%，密度1.134 g/mL的乙酰丙酸(Acros Organics公司, 美國(guó))(按體積分?jǐn)?shù)配制所需的不同濃度溶液)，十二烷基硫酸鈉(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制所需的不同濃度溶液)，兩者具體配比參考文獻(xiàn)[9]；有效氯含量為1 000 mg/L的次氯酸鈉(北京洗得寶消毒制品有限公司)，商用名“84消毒液”(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制)。

3)中和劑：LVA-SDS中和劑[7]為0.1 mol/L PBS溶液，次氯酸鈉中和劑[12-13]為5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液。

4)有機(jī)干擾物：3%(體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白(BSA)。

5)試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，采用區(qū)組隨機(jī)化分組，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYSK(京)2015-0007。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017-6)。

1.2 懸液定量殺菌試驗(yàn)[13]

1)菌懸液制備：在無菌磨菌瓶中加入1～2滴10%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-80水溶液，用無菌吸管尖端或無菌接種環(huán)刮取2～3周改良羅氏培養(yǎng)基處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌落，置于磨菌瓶中。之后旋緊瓶蓋在渦旋振蕩器上振蕩30～60 s。靜置10 min后，打開瓶蓋，加入約2 mL無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，輕輕晃動(dòng)后靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀。用無菌吸管吸取中上部的菌液約1 mL，轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?。逐漸滴加無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，直至菌液濁度與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，即得? mg/mL的菌懸液，備用。

2)中和劑鑒定試驗(yàn)：具體操作詳見2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]規(guī)定的中和劑試驗(yàn)方法，現(xiàn)簡(jiǎn)述如下：設(shè)置平行6組實(shí)驗(yàn)，按照懸液定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行。①消毒劑+菌懸液；②(消毒劑+菌懸液)+中和劑；③中和劑+菌懸液；④(消毒劑+中和劑)+菌懸液；⑤稀釋液+菌懸液(正常菌陽性對(duì)照)；⑥稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)。其中稀釋液為去離子水；②組和④組區(qū)別在于：④組消毒劑與中和劑先接觸，終止消毒劑的殺滅效能；而②組消毒劑與菌懸液先接觸，之后使用中和劑，主要用于控制消毒劑的殺滅時(shí)間。消毒劑與細(xì)菌懸液作用5 min，試驗(yàn)在常溫下進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次(每次3個(gè)重復(fù)，共做了3次)均符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的中和劑評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，表明所選中和劑及其濃度適宜。

3)懸液定量殺菌試驗(yàn)：在無菌試管內(nèi)加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機(jī)干擾物[3%(體積分?jǐn)?shù))BAS]，置于(20±1)℃水浴中備用。加入4 mL倍比稀釋的LVA-SDS消毒劑[陽性對(duì)照為0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，陰性對(duì)照為1 000 mg/L含氯消毒劑]，立即混勻。作用5、15、30 min后，取0.5 mL混合液加入4.5 mL中和劑，混合中和作用10 min。取0.1 mL混合液置于7H10固體培養(yǎng)基上，用L棒涂抹均勻，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1個(gè)月，觀察結(jié)果并記錄菌落總數(shù)(CFU/mL)，計(jì)算平均殺滅對(duì)數(shù)值(N)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。按照下列公式計(jì)算平均殺滅對(duì)數(shù)值：平均殺滅對(duì)數(shù)值(N)=對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值(No)-試驗(yàn)組活菌濃度的對(duì)數(shù)值(Nx)。

1.3 消毒劑的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)[13]

1)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)選用該方法用于評(píng)價(jià)消毒劑的急性毒性反應(yīng)。采用一次最大限度試驗(yàn)法。選用SPF級(jí)BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，采用灌胃方式，按照0.4 mL·20 g-1給予受試液[20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS]，用灌胃針頭將受試液經(jīng)口一次給予動(dòng)物，連續(xù)觀察14 d，觀察并記錄動(dòng)物中毒的表現(xiàn)和死亡情況，計(jì)算LD50(采用累積法計(jì)算LD50)。試驗(yàn)結(jié)束后，處死存活動(dòng)物，進(jìn)行解剖，肉眼觀察是否出現(xiàn)組織和臟器異常。

2)蓄積毒性試驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)選用該方法用于評(píng)價(jià)消毒劑的慢性毒性反應(yīng)。選用SPF級(jí)BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。采用灌胃方式，每天灌胃一次，按照0.4 mL·20 g-1計(jì)算染毒量，每4天為一期。第一期劑量為0.1 LD50，以后每期的劑量按照《消毒技術(shù)規(guī)范》中定期遞增染毒劑量用表中所示遞增，直至半數(shù)動(dòng)物死亡為止，計(jì)算累積總劑量即為L(zhǎng)D50(n)。如果給藥28天，死亡動(dòng)物仍不足半數(shù)，即停止實(shí)驗(yàn)。蓄積系數(shù)(K)公式：K=LD50(n)/LD50，計(jì)算并確定蓄積毒性分級(jí)。

3)皮膚刺激試驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)選用該方法用于評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)皮膚是否存在刺激性。選用SPF級(jí)BALB/c小鼠6只，雌雄各半。試驗(yàn)前24 h觀察小鼠耳緣皮膚是否完好，無破損，次日將消毒液(20%LVA+2%SDS)直接涂抹于一側(cè)完整的皮膚上，另一側(cè)作為空白對(duì)照。分別于1、24、48 h后觀察皮膚的局部反應(yīng)，根據(jù)有無紅斑和水腫形成，進(jìn)行皮膚反應(yīng)刺激評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

第1組無菌落生長(zhǎng)。第2組有菌落生長(zhǎng)，較第1組為多，但較第3、4、5組為少。第3、4、5組，組間菌落數(shù)在1×107～5×107CFU/mL，誤差率不超過15%。第6組無菌落生長(zhǎng)，詳見表1。結(jié)果表明，0.1 mol/L PBS溶液可以有效中和濃度20%(體積分?jǐn)?shù))LVA、20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS的消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殘留作用，且中和劑及其產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)和培養(yǎng)基無不良影響，符合有效中和劑結(jié)果判定要求。5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液均可以有效中和濃度為1 000 mg/L的次氯酸鈉，符合有效中和劑結(jié)果判定要求。

2.2 懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS作用30min對(duì)菌懸液內(nèi)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的殺滅對(duì)數(shù)值(5.03 ±0.17vs5.53 ±0.38)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；20%LVA 及20%LVA+2%SDS和1 000mg/L次氯酸鈉(6.20 ±0.00)的殺滅對(duì)數(shù)值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表2。

表1 含氯消毒劑、LVA和LVA-SDS消毒劑的中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Neutralizer qualification test results for chlorine-containing disinfectants, LVA, and LVA-SDS disinfectants

LVA：levulinic acid；SDS：sodium dodecyl sulfate.

20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量指數(shù))SDS作用30min對(duì)菌懸液內(nèi)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅對(duì)數(shù)值(5.03 ±0.15vs5.12± 0.06)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；20%(體積分?jǐn)?shù))LVA 及20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS和1 000mg/L次氯酸鈉殺滅對(duì)數(shù)值(6.17 ±0.00)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；詳見表3。含有效氯1 000mg/L的“84消毒液”對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用強(qiáng)于20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS。

表2 LVA-SDS在不同濃度、時(shí)間條件下對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的殺滅作用Tab.2 Killing effect of LVA-SDS on Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv at different concentrations and times

表3 LVA-SDS在不同濃度、時(shí)間條件下對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用Tab.3 Killing effect of LVA-SDS on clinical isolates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis at different concentrations and times

2.3 LVA-SDS的安全性毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

1)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：結(jié)果為L(zhǎng)D50>5 000 mg/kg，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的毒性評(píng)價(jià)可知，該消毒劑屬實(shí)際無毒級(jí)。試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)異常，無死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖處死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，肉眼觀察未見任何組織或臟器異常。

2)蓄積毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行28 d，小鼠均無死亡，蓄積系數(shù)K>5，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的蓄積毒性分級(jí)可知，該消毒劑為輕度蓄積毒性。

3)皮膚刺激試驗(yàn)：觀察1、24、48 h后，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)無紅斑和水腫形成，皮膚刺激積分均為0，皮膚刺激指數(shù)<0.5，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的皮膚刺激評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知，對(duì)小鼠皮膚無刺激性。

3 討論

結(jié)核病是目前由單一致病菌導(dǎo)致死亡最多的疾病，是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題之一。我國(guó)是全球27個(gè)耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，2007-2008年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者中耐多藥率為8.32%。據(jù)此估算，我國(guó)每年新發(fā)耐多藥結(jié)核患者12萬例，耐多藥結(jié)核病患者數(shù)位居全球第2位。耐多藥肺結(jié)核患者與普通肺結(jié)核患者相比，傳染期更長(zhǎng)，傳染危害更大[14]。消毒劑是切斷結(jié)核分枝桿菌傳播途徑的有效手段之一，對(duì)消毒劑的研究應(yīng)引起研究者的重視。

本研究結(jié)果表明，LVA-SDS消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均存在較好的殺滅作用。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的一系列梯度濃度的消毒劑得到的殺滅試驗(yàn)結(jié)果顯示，LVA-SDS消毒劑的殺滅作用隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加不斷增強(qiáng)；20%LVA、20%LVA+2%SDS對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對(duì)數(shù)值均>5.00，且連續(xù)培養(yǎng)觀察2～3個(gè)月后未見新鮮菌落生長(zhǎng)。20%(體積分?jǐn)?shù))LVA、20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS、1 000 mg/L次氯酸鈉和陽性對(duì)照組對(duì)結(jié)核分枝桿菌及耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min的殺滅作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相比同濃度的LVA， LVA-SDS聯(lián)合作用的殺滅作用會(huì)更趨于穩(wěn)定，效果會(huì)更好，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[9,15]一致，即兩者具有協(xié)同殺滅作用。LVA-SDS對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株殺滅作用與消毒劑的濃度和作用時(shí)間成正相關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果LVA-SDS有可能用于臨床結(jié)核分枝桿菌的滅菌消毒，如器械消毒、空氣消毒等。結(jié)合本研究獲得的毒理學(xué)結(jié)果，LVA-SDS在未來殺滅結(jié)核分枝桿菌的過程中具有對(duì)皮膚無刺激性、對(duì)人體無急性和慢性毒性等優(yōu)勢(shì)。可見，LVA-SDS對(duì)結(jié)核分枝桿菌除了有很好的殺滅作用，還具有很好的安全性、無腐蝕性、無害無污染、無刺激性、無不良作用等優(yōu)點(diǎn)[9,15-16]。LVA-SDS混合液在常溫下保存60 d性質(zhì)穩(wěn)定且殺滅活性不變[17]。

1 000 mg/L含氯消毒劑的對(duì)照組對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對(duì)數(shù)值均>5.00，可達(dá)到完全殺滅作用?？梢?，含氯消毒劑確實(shí)存在較強(qiáng)的殺滅作用。與含氯消毒劑相比較，LVA-SDS消毒劑雖然在短時(shí)間和低濃度時(shí)的殺滅作用稍差，但是高濃度和長(zhǎng)時(shí)間作用后卻有著不錯(cuò)的殺滅效果。另外LVA-SDS具有無害無污染、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，而含氯消毒劑具有刺激性強(qiáng)和腐蝕性等缺點(diǎn)。因此，LVA-SDS用于結(jié)核分枝桿菌的消毒工作具有不錯(cuò)的應(yīng)用前景。

本研究顯示，LVA-SDS對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株具有較好的殺滅作用，且毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LVA-SDS消毒劑屬實(shí)際無毒級(jí)，輕度蓄積毒性作用且對(duì)皮膚無刺激性，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。筆者在后續(xù)研究中會(huì)結(jié)合醫(yī)院感染控制的實(shí)際需要，不斷改變LVA-SDS對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺滅作用的實(shí)驗(yàn)條件和影響因素，進(jìn)一步提高LVA-SDS消毒劑的應(yīng)用價(jià)值。