辛明蔚 何軍琴* 賈朝霞 武 穎 張 瑩 楊 維 尹曉丹

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科, 北京 100026； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院群體保健科, 北京 100026)

近幾年，生活壓力大，精神緊張焦慮，熬夜、吸煙等不良生活習(xí)慣嚴重損害女性卵巢功能，并且卵巢的壽命比機體其他器官短并且衰老速度快。卵巢功能減退及其引發(fā)的不孕癥已成為目前嚴重困擾現(xiàn)代女性的重大醫(yī)學(xué)問題。對女性來說，卵巢衰老與生育能力、圍絕經(jīng)期及心血管癥狀等多種慢性疾病有關(guān)，所以亟需明確卵巢功能減退的生理及病理機制并確定有效的治療方案。研究[1-2]表明中醫(yī)藥在促進卵泡的發(fā)育、提高子宮內(nèi)膜容受性及減少西藥的不良反應(yīng)等方面具有顯著優(yōu)勢，但其作用機制尚不明確。本研究借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)卵巢功能減退發(fā)病機制的認識及檢測手段，探討溫腎養(yǎng)血方提高卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能的作用機制，為中西醫(yī)結(jié)合治療高齡女性不孕癥提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與儀器

中藥飲片購自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養(yǎng)血方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院趙松泉主任醫(yī)師自擬方：柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當(dāng)歸、川芎、蒲黃、熟地、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細辛、肉蓯蓉等。溫腎方：肉蓯蓉、鹿角、淫羊藿、菟絲子、枸杞子、覆盆子。養(yǎng)血方澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當(dāng)歸、蒲黃、赤芍、川芎、木香、香附。中藥在首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑實驗室，水煎后濃縮成藥液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(以色列Prospec公司，貨號：HOR-272)；人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin， HCG)(以色列Prospec公司，貨號：P139079)。37 ℃孵育箱，體視鏡，細胞培養(yǎng)皿，1.5 mL 離心管 (eppendorf,EP)。

1.2 實驗動物及分組方法

SPF級8月齡ICR雌性小鼠，20 只，體質(zhì)量 40 g 左右；8～9周齡ICR 雄鼠5只，體質(zhì)量22 g左右，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。

將實驗動物采用數(shù)字表法隨機分為對照組、PMSG組、A、B、C共5組(A：溫腎養(yǎng)血組、B：溫腎組、C：養(yǎng)血組)，根據(jù)結(jié)果進行調(diào)整，使5組動物數(shù)量相等，每組4只，能滿足統(tǒng)計需要。

1.3 給藥及取材方法

參考文獻[3]連續(xù)每日定時(下午6時)灌胃給藥10 d，第11天對PMSG組、溫腎養(yǎng)血組、溫腎組、養(yǎng)血組雌鼠同時腹腔注射PMSG 10 IU/只，對照組雌鼠同時注射200 μL 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，48 h后，腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)10 IU/只，并于注射HCG后14 h。各組小鼠剖腹取出小鼠卵巢及輸卵管，以無菌針頭輕輕劃破輸卵管壺腹部收集卵丘復(fù)合物，評估卵細胞質(zhì)量，同時對卵細胞形態(tài)進行評價，立即以80 IU/mL的透明質(zhì)酸酶處理卵丘復(fù)合物，剔除卵母細胞周圍的卵丘細胞，用吸卵管反復(fù)吹打后，將處理好的卵母細胞移入含10%(體積分數(shù))血清替代補充成分(synthesis serum substituent, SSS)的改良人輸卵管液 (modified human tubal fluid,mHTF)培養(yǎng)液中反復(fù)洗滌6次后，選形態(tài)較好的MⅡ期卵母細胞，置于含10%(體積分數(shù))SSS的HTF培養(yǎng)液，放入37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.4 獲取精子

取8～9周齡ICR 雄鼠，剖開陰囊，取出附睪及輸精管，于含10%SSS的mHTF培養(yǎng)液中撕裂，使精子游出，并于37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h獲取備用。

1.5 體外受精和培養(yǎng)

用上游法優(yōu)化精液，在培養(yǎng)箱中獲取1.0～1.5 h。將成熟卵母細胞移入受精滴，以(2～5)×106/mL個活精子進行受精4～6 h, 在顯微鏡下觀察有原核產(chǎn)生即為受精成功。

1.6 胚胎發(fā)育指標(biāo)觀察

1.6.1 受精情況觀察

受精觀察根據(jù)卵母細胞有無第二極體排出以及透明帶周圍有無精子附著判斷卵母細胞有無受精。若培養(yǎng)48 h未見第二極體排出及原核形即判定為卵母細胞未受精。計數(shù)每只鼠的受精卵細胞數(shù)、卵細胞總數(shù)、正常卵裂球數(shù)。受精率=受精卵細胞數(shù)/卵細胞總數(shù)，卵裂率=正常卵裂球數(shù)/受精卵總數(shù)。

1.6.2 各組不同培養(yǎng)時間胚胎細胞數(shù)的觀察

計數(shù)每只鼠的2 細胞率、4細胞率、8細胞率、桑葚胚率、囊胚率的數(shù)量。2 細胞率=達到 2 細胞數(shù)/受精卵細胞數(shù)；4 細胞率=達到 4 細胞數(shù)/受精卵細胞數(shù)；8 細胞率=達到 8 細胞數(shù)/受精卵細胞數(shù)；桑葚胚率=達到桑葚胚數(shù)/受精卵細胞數(shù)；囊胚率=達到囊胚數(shù)/受精卵細胞數(shù)。

1.7 采用定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技術(shù)檢測卵母細胞和受精卵的線粒體脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)

1.7.1 單個卵細胞DNA提取及引物設(shè)計

取單個卵母細胞或胚胎分裝于0.2 mL薄壁PCR管中，每管各加20 μL去離子水，液氮反復(fù)凍融次裂解細胞釋放備用。引物根據(jù)基因庫公布的人線粒體基金組中ND1基因序設(shè)計，上游引物：5′-CCCGCTCTACCTCACCAT-3′； 下游引物：5′-GCCCATTTCTTCCCATTT-3′(由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成)。

1.7.2 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品制備

以上述方法裂解單個卵母細胞所得DNA為模板，在20 μL體系中加入12.5 μL PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)上、下游引物各1 μL，標(biāo)準(zhǔn)樣本或待測樣本模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL；95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s，在72 ℃采集熒光信號，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min；3%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠, 100 V恒壓電泳, 紫外分析儀下觀察擴增產(chǎn)物。

1.7.3 線粒體DNA拷貝數(shù)測定

以SYBR Green法定量PCR技術(shù)測定各組卵母細胞和受精卵線粒體DNA拷貝數(shù)(ABI7300)。

在20 μL體系中加入12.5 μL SYBR Green PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)，上下游引物各1 μL，標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本模板DNA 2 μL， ddH2O 8.5 μL進行熒光定量PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s, 60 ℃ 20 s, 在72 ℃采集熒光信號，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各組卵母細胞和受精卵線粒體拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同給藥組小鼠受精率和卵裂率

5組間受精率經(jīng)列聯(lián)表χ2檢驗表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.496，P=0.009)；組間兩兩比較，溫腎養(yǎng)血組與對照組、溫腎組和養(yǎng)血組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.409，P=0.004；χ2=3.847，P=0.050；χ2=4.670，P=0.031)。5組卵裂率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.070，P=0.000)，進行兩兩比較，溫腎養(yǎng)血組與對照組、溫腎組和養(yǎng)血組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.940，P=0.047；χ2=5.726，P=0.017；χ2=8.542，P=0.003)。溫腎養(yǎng)血組、溫腎組、養(yǎng)血組的受精率和卵裂率明顯高于PMSG組和對照組(P<0.05)，溫腎養(yǎng)血組的受精率和卵裂率最高(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 不同給藥組小鼠的受精率和卵裂率Fig.1 Fertilization rate and cleavage rate of mice in different drug administration groupsA：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction；PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

2.2 各組不同培養(yǎng)時間胚胎細胞數(shù)的觀察

經(jīng)列聯(lián)表χ2檢驗表明，2細胞期(χ2=12.583，P=0.014)，4細胞期(χ2=9.671，P=0.046)，8細胞期(χ2=10.080，P=0.039)，桑葚胚期(χ2=10.072，P=0.045)，囊胚數(shù)(χ2=9.985，P=0.041)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與受精率和卵裂率相一致，溫腎養(yǎng)血組與PMSG組相比在2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑葚胚期和囊胚期的發(fā)育差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，P=0.008，P=0.006，P=0.009，P=0.008)，詳見圖2。

2.3 各組對卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

以SYBR Green法定量PCR技術(shù)測定各組卵母細胞和受精卵線粒體DNA拷貝數(shù),標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋拷貝數(shù)梯度為2×105至7×107(copies/μL)，反應(yīng)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2=1，表明實驗數(shù)據(jù)可靠。根據(jù)反應(yīng)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣本反應(yīng)2-△△CT值，獲得各組卵母細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)(F=60.072，P<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。溫腎養(yǎng)血組線粒體拷貝數(shù)平均值1.78×105與對照組線粒體拷貝數(shù)平均值1.56×105(copies/μL)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相對于對照組，其他各組的線粒體DNA拷貝數(shù)均明顯提高，其中溫腎養(yǎng)血組的線粒體DNA拷貝數(shù)最高，詳見圖3，4。

圖2 各組不同培養(yǎng)時間對胚胎細胞數(shù)的觀察Fig.2 Observation on the number of embryonic cells in different culture timeA：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction；PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

圖3 卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Oocyte mitochondrial DNA copy number detection standard curve

圖4 不同給藥組小鼠卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的統(tǒng)計Fig.4 Statistical results of oocyte mitochondrial DNA copy number in mice of different drug administration groups*P<0.05， **P<0.01 vs control group;A：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction;PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

2.4 各組對受精卵線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

在檢測卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)變化的基礎(chǔ)上，進一步對各組受精卵細胞線粒體DNA拷貝數(shù)進行了檢測，結(jié)果見圖4。經(jīng)方差分析結(jié)果表明小鼠受精卵線粒體DNA 拷貝數(shù)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.359，P=0.000)。與卵母細胞的檢測結(jié)果相似，相對于對照組組，其他各組的線粒體DNA拷貝數(shù)均明顯提高，提示溫腎養(yǎng)血方及溫腎方和養(yǎng)血方在卵母細胞受精后，同樣可以通過提高線粒體中ATP的積累，為受精卵的發(fā)育提供能量保障。此外，同樣與卵母細胞的檢測結(jié)果相似，溫腎養(yǎng)血方的線粒體DNA拷貝數(shù)2.86×105copies/μL最高，進一步說明溫腎養(yǎng)血方在提高線粒體DNA拷貝數(shù)方面的作用效果更佳。

圖5 不同給藥組小鼠受精卵線粒體DNA拷貝數(shù)檢測結(jié)果Fig.5 Mitochondrial DNA copy number detection results of different groups of fertilized eggs*P<0.05, **P<0.01 vs control group；A：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C： Yangxue decoction； PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

3 討論

“女子七歲腎氣盛，齒更發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子，五七陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮；六七任脈衰于上，面始焦，發(fā)始白；七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗穂4]這段經(jīng)文提出了天癸的至與竭和腎氣的盛衰密切相關(guān)且年齡是天癸至、盛、衰、竭的唯一且關(guān)鍵因素。五七以后，腎精、腎氣逐漸衰少，天癸亦隨之衰減漸至衰絕。沒有了天癸的激發(fā)作用，生殖機能逐漸衰退，生殖器官日趨萎縮，最后喪失生殖機能而進入圍絕經(jīng)期。因此，腎的功能關(guān)系到人的生殖機能，是人類生育繁衍的根本。女子“以血為本，以血為用”，沖為血海，任主胞胎，臟腑之血皆歸沖脈。沖任之本在腎，腎氣虧虛，沖任不充，天癸竭，無血可下，可導(dǎo)致腎虛血虧卵泡不能得到充足的滋潤、濡養(yǎng)，難以發(fā)育成為成熟卵泡；腎精匱乏，不能化生為血，血脈空虛不盈，必然導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良，卵子老化。腎虛則沖任不充，血虛則沖任不暢，氣血無以順利下行，故腎虛可以致血虛，因虛又可致瘀，而瘀阻脈絡(luò)，又有礙腎氣的生化、腎陽的鼓動、腎陰的滋養(yǎng)，而加重腎虛。因虛致瘀，因瘀加重虛，互為因果而形成惡性循環(huán)。因此，高齡女性卵子老化的病機腎虛為本，血虛血瘀為標(biāo)。

血貴充盈，喜暢通。血的滿盈，是其發(fā)揮營養(yǎng)作用的前提。反之，血量不足，致使“其脈空虛”(《靈樞·決氣》[4])，血營養(yǎng)作用則無從發(fā)揮。血宜溫而不宜寒，溫則流動?！秼D人大全良方·調(diào)經(jīng)門》[5]中闡述：“血性得溫則宣流，得寒則澀閉。”因此，在臨床上常采用標(biāo)本兼治之法，即溫腎以治其本，養(yǎng)血以治其標(biāo)。精血之源在于腎，腎為人身之化機，溫腎以化精生血，溫腎方藥可使腎氣得充，氣旺血生，增強活血通絡(luò)之功；寓活血于養(yǎng)血中，可使氣機調(diào)暢，瘀血祛除，與有利于溫腎方藥功效的發(fā)揮。

近年來高齡女性要求生育的意愿增強，胚胎流產(chǎn)和畸形的風(fēng)險增加，如何提高高齡女性的生育能力也成為探討的熱點和重點問題。卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量決定了卵巢儲備功能。卵母細胞數(shù)量隨年齡增長逐漸減少且不可再生，因此卵母細胞質(zhì)量是決定卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素[6-7]。衰老造成的卵母細胞退化是女性生育能力下降的主要因素[8]，是造成不孕和反復(fù)流產(chǎn)的主要原因。線粒體功能的減退與衰老密切相關(guān)[9]。人成熟的卵母細胞是人體內(nèi)線粒體含量最多的細胞，有超過十萬個線粒體。線粒體是細胞中重要的能量工廠，為卵母細胞成熟、精卵結(jié)合及胚胎發(fā)育等生命活動提供必要的代謝產(chǎn)物。人成熟卵母細胞中每個線粒體含有1～2個線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，而mtDNA拷貝數(shù)范圍在3萬～100萬，在卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)與受精、胚胎發(fā)育潛能成正相關(guān)[10-11]。mtDNA復(fù)制是受到嚴格調(diào)控的，如果卵母細胞發(fā)育成熟過程中復(fù)制障礙或者著床前過早恢復(fù)復(fù)制均會影響胚胎發(fā)育[12]。與細胞核DNA相比，mtDNA因缺乏組蛋白的保護和必要的損傷修復(fù)系統(tǒng)[13]，且處于高自由基的環(huán)境中，更容易突變或受損，從而影響受精率和胚胎發(fā)育潛能。同時其形態(tài)及分布也在卵母細胞發(fā)育的過程中產(chǎn)生顯著的變化，因此認為，線粒體的各項指標(biāo)是衡量卵母細胞胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。

因卵母細胞成熟后 (MⅡ期)mtDNA停止復(fù)制，直至囊胚期才恢復(fù)，胞質(zhì)中的線粒體對胚胎的發(fā)育顯得尤為重要。在哺乳動物發(fā)育過程中，因為受精過程中精子的線粒體被破壞了，所以胚胎中的線粒體全部依賴于卵母細胞，MII期的卵母細胞與受精卵含有同樣的mtDNA，卵母細胞線粒體的功能對早期胚胎質(zhì)量產(chǎn)生重要影響，決定著胚胎質(zhì)量[10]。受精失敗和低質(zhì)量的卵母細胞中mtDNA的拷貝數(shù)明顯低于正常卵母細胞[14]。排卵后，卵母細胞線粒體的能量供應(yīng)才開始啟動，并在卵母細胞和胚胎的不同發(fā)育階段產(chǎn)生顯著的形態(tài)學(xué)和分布上的變化，為重要的生物學(xué)事件“定點”提供能量供應(yīng)。同時，線粒體還具有DNA的半自主細胞器，mtDNA復(fù)制的保真度受到各種輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)手段和女性年齡的影響，并與凋亡程序的啟動密切相關(guān)。現(xiàn)有研究表明，控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)及其他ART治療方法，可以直接干擾卵母細胞線粒體的功能，可能使COH 及ART的胚胎與自然排卵及體內(nèi)受精的胚胎不同。因此，線粒體功能正常象征著卵母細胞健康、質(zhì)量高和具有良好的發(fā)育潛能[15]，保護和改善卵母細胞線粒體功能可以直接提高ART的成功率和安全性[16]。線粒體是細胞的“能量工廠”，參與細胞生長、分化、增生、凋亡、信號傳導(dǎo)等細胞活動，腎陽主宰著人體一身之陽，為人體生命活動的原動力，因此溫腎養(yǎng)血能提高線粒體mtDNA，提高卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。本研究結(jié)果顯示溫腎方和養(yǎng)血方均可提高小鼠的受精率和卵裂率，但是溫腎養(yǎng)血方的效果最好。同樣，三方均可提高小鼠卵母細胞和受精卵的mtDNA，溫腎養(yǎng)血方的效果最顯著。精血之源在于腎，腎為人身之化機，溫腎以化精生血，溫腎方藥可使腎氣得充，氣旺血生，增強活血通絡(luò)之功；寓活血于養(yǎng)血中，可使氣機調(diào)暢，瘀血祛除，有利于溫腎方藥功效的發(fā)揮。所以與溫腎方和養(yǎng)血方相比，溫腎養(yǎng)血方能更好地提高卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。