周鋒 褚雪峰 史發(fā)蘭

【摘要】 目的 探討DNA損傷蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)MDM2產(chǎn)生剪切體的表達(dá)。方法 采用多種DNA損傷藥物處理原代胚胎成纖維細(xì)胞后， 分別利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time PCR）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)MDM2的剪接體表達(dá)， 進(jìn)一步通過測(cè)序分析剪切體的序列。結(jié)果 蒽環(huán)類藥物可以誘導(dǎo)MDM2的第10號(hào)和第11號(hào)外顯子中間插入108 bp的片段， 并且該片段中含有終止密碼子， 促使丟失第11號(hào)和第12號(hào)外顯子。羥基脲（Hu）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）并不能誘導(dǎo)MDM2剪接體的產(chǎn)生。結(jié)論 蒽環(huán)類藥物可以誘導(dǎo)MDM2剪切體的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 蒽環(huán)類藥物；MDM2；剪接體實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.35.113

【Abstract】 Objective To discuss the expression of DNA damage anthracyclines induced MDM2 spliceosome. Methods After treatment of primary embryonic fibroblasts with various DNA-damaging drugs， the expression of splicesome of MDM2 was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-Time PCR） and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）， respectively， and the sequence of the splicing was further analyzed by sequencing. Results Anthracyclines can induce the insertion of 108 bp fragment between exons 10 and 11 of MDM2， and the fragment contains termination codon， which leads to the loss of exons 11 and 12. hydroxyurea （Hu） and 5-fluorouracil （Fu） could not induce the production of MDM2 splice. Conclusion Anthracyclines can induce the expression of MDM2 spliceosome.

【Key words】 Anthracyclines； MDM2； Spliceosome

MDM2是一個(gè)含有雙微體的蛋白， 在細(xì)胞內(nèi)主要作用參與調(diào)控真核細(xì)胞的生長(zhǎng)、程序化死亡和DNA損傷的修復(fù)等[1-4]。MDM2位于人類染色體12q13-14上， 由12個(gè)外顯子編碼491個(gè)氨基酸[5]。MDM2的表達(dá)在人體正常多個(gè)組織和器官中， 骨骼肌中表達(dá)最高， 其次為肝、肺等， 與細(xì)胞的基本生理活動(dòng)有關(guān)[6， 7]。此外， 在人類許多腫瘤中， 如肺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌中， 都可以檢測(cè)到MDM2基因的擴(kuò)增表達(dá)[8-10]。MDM2具有多種功能， 研究最廣泛的是其具有E3泛素連接酶活性[11， 12]。在癌癥中其主要功能是降解抑癌基因P53， 促進(jìn)腫瘤的形成[13]。但是突變或者過表達(dá)的P53也可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制MDM2的表達(dá)， 使其在癌癥中失去功能。MDM2主要的功能區(qū)域分成2個(gè)。第一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域是1～241位氨基酸， 主要功能是結(jié)合P53， 使P53調(diào)控細(xì)胞周期G1期的功能喪失同時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能失去。這個(gè)區(qū)域同時(shí)還可以結(jié)合P73和E2F1蛋白。第二個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域是242～331位氨基酸， 其中包含了C4種類的鋅指結(jié)構(gòu)域， 具有重要的E3泛素化P53蛋白的能力[14]。另外MDM2含有一個(gè)核定位信號(hào)序列（NLS）， 包括核輸出信號(hào)（NES）和核定位信號(hào)（NoLS）[15]。 目前已知的MDM2轉(zhuǎn)錄由兩個(gè)啟動(dòng)子控制， 可以產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本。這兩個(gè)啟動(dòng)子最大的區(qū)別在于是否依賴于P53。第一個(gè)啟動(dòng)子無P53的結(jié)合位點(diǎn)， 第二個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域中含有2個(gè)P53結(jié)合位點(diǎn)， 結(jié)合時(shí)可以激活MDM2的轉(zhuǎn)錄。研究還發(fā)現(xiàn)MDM2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)（SNP309）， SNP309位點(diǎn)突變時(shí)（T-G）， 會(huì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子SP1與MDM2的結(jié)合增強(qiáng)， 進(jìn)而上調(diào)MDM2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平， 促進(jìn)腫瘤的形成。還有研究發(fā)現(xiàn)， PTEN可以通過P1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)MDM2的mRNA水平[16]。迄今為止， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在不同癌癥中MDM2有多達(dá)72種選擇性剪切[17， 18]。但是這些選擇性剪切產(chǎn)物的形成和誘因并不清楚。

蒽環(huán)類藥物是一類抗腫瘤效果非常顯著的藥物， 無論在血液腫瘤或者實(shí)體腫瘤中都具有很好的治療效果， 在癌癥的治療中具有極其重要的地位。目前， 常見的蒽環(huán)類藥物主要有阿霉素（Dox）、表阿霉素、柔紅霉素和伊比達(dá)星等[19]。蒽環(huán)類藥物作用于腫瘤的機(jī)制大多以DNA為作用靶點(diǎn)， 利用平面的稠環(huán)芳香結(jié)構(gòu)嵌入到DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中， DNA聚合酶和核酸的合成過程受阻， 導(dǎo)致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)破壞， 阻礙了癌細(xì)胞的增殖， 最終發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷藥物Dox及蒽環(huán)類藥物均可以誘導(dǎo)MDM2剪切體的表達(dá)， 插入的剪切體可終止密碼子， 阻斷MDM2的轉(zhuǎn)錄， 使其失去了部分功能， 這一研究闡明了DNA損傷藥物蒽環(huán)類化療藥誘導(dǎo)MDM2剪切體表達(dá)的分子機(jī)制。為蒽環(huán)類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)用原代胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）取自懷孕13.5 d小鼠， 由實(shí)驗(yàn)室自行制備。實(shí)驗(yàn)試劑：HDMEM（高糖）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購于美國(guó)Gibco公司。Realtime-PCR使用的SYBR購于日本TAKARA公司。RNA提取試劑TRIZOL試劑購自賽默飛公司。實(shí)驗(yàn)用限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購于NEB公司。實(shí)驗(yàn)所用的Dox、表阿霉素、柔紅霉素、伊比達(dá)星、Hu和5-Fu均購自Sigma公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 MEFs細(xì)胞制備與培養(yǎng) 首先將懷孕13.5 d的母鼠麻醉， 利用CO2處理母鼠致死后， 剪開腹壁暴露出子宮角。隨后取出胚胎將其轉(zhuǎn)移到含有PBS的培養(yǎng)皿中， 洗3遍。洗完后， 用眼科剪刀將組織剪碎， 大約碎塊1 mm3。吸出轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中， 加入2 ml胰蛋白酶/EDTA在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育大約20 min。用10 ml培養(yǎng)基（含10%FBS）終止胰蛋白酶/EDTA的消化， 1500 rpm離心后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)。37℃培養(yǎng)過夜， 當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%匯合時(shí)并仍處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)， 可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1. 2. 2 蒽環(huán)類藥物處理MEFs細(xì)胞 將MEFs細(xì)胞種6孔板后， 每孔1×106細(xì)胞， 分別利用10 ?M的阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、伊比達(dá)星和2 μl DMSO處理MEFs細(xì)胞， 作用24 h后提取RNA。

1. 2. 3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA水平 采用TRIZOL法提取總RNA， 利用紫外分光光度計(jì)NANO Drop3000檢測(cè)RNA的純度及濃度。提取2 μg RNA利用cDNA第1條鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA， 成功后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)。使用7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）， 按照Invitrogen PCR操作手冊(cè)進(jìn)行Real-Time PCR。

PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)變性， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)， 以2-△△CT值評(píng)估相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。所用實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在NCBI網(wǎng)站查取MDM2的基因序列NM_010786， 為了防止基因組DNA污染， 跨外顯子設(shè)計(jì)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用2-△△ct法處理實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所得的CT數(shù)據(jù)， 采用SPSS 15.0軟件處理獲得的數(shù)據(jù)， 由于實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本2-△△ct值不符合正態(tài)分布， 以2個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)， 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)， P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 Dox誘導(dǎo)MEFs細(xì)胞出現(xiàn)MDM2的剪切體 利用誘導(dǎo)DNA損傷藥物Dox（Doxorubicin）處理MEFs細(xì)胞后， 提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)MDM2的表達(dá)。根據(jù)MDM2的序列， 在跨第10號(hào)和第11號(hào)外顯子設(shè)計(jì)引物， 目的片段長(zhǎng)度150 bp， 見圖1。結(jié)果顯示， 在對(duì)照組（DMSO）檢測(cè)到了目的片段150 bp， 在Dox誘導(dǎo)組不僅檢測(cè)到了150 bp目的片段， 另外還檢測(cè)到了一條250 bp左右的片段。綜合以上結(jié)果， 準(zhǔn)備對(duì)Dox處理MEFs細(xì)胞后MDM2剪切體250 bp片段進(jìn)行下一步研究， 見圖2。

2. 2 Dox誘導(dǎo)MDM2剪切體的研究 利用誘導(dǎo)DNA損傷藥物Dox處理MEFs細(xì)胞后， 擴(kuò)增MDM2后將250 bp片段切膠回收， 克隆到T載體后進(jìn)行測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)在第10號(hào)和第11號(hào)外顯子之間插入了一段108 bp片段， 并且這段序列中有終止密碼子TGA。進(jìn)一步根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)Real time-PCR引物， 證實(shí)了Dox可以誘導(dǎo)MDM2的剪切體。見圖3。

2. 3 Hu和5-Fu不可以誘導(dǎo)MDM2的剪切體表達(dá) 誘導(dǎo)DNA損傷的藥物有很多種， 比如Hu、5-Fu等， 分別利用Hu和5-Fu處理MEFs細(xì)胞后， 進(jìn)行PCR的檢測(cè)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有Dox可以誘導(dǎo)MDM2的剪切體表達(dá)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4， 圖5。

2. 4 蒽環(huán)類藥物均可以誘導(dǎo)MDM2的剪切體表達(dá) 蒽環(huán)類藥物主要包括Dox、表阿霉素、柔紅霉素和伊比達(dá)星等（見圖6）。為了探索MDM2剪切體的表達(dá)， 分別用這4種藥物處理MEFs細(xì)胞后， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示， 這4種藥物均可以誘導(dǎo)MDM2剪切體的表達(dá)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖7， 見圖8。

3 討論

P53是一個(gè)DNA損傷應(yīng)激蛋白， 可以參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡， 細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老[20， 21]。MDM2是P53的主要負(fù)調(diào)控基因， 通過泛素化降解P53[22]。目前， 很多研究發(fā)現(xiàn)MDM2的功能與它本身mRNA的選擇性剪切與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在多種癌癥中都發(fā)現(xiàn)了MDM2存在不同的剪切體， 然而它的功能和發(fā)生原因還不清楚。本研究中發(fā)現(xiàn)了DNA損傷時(shí)可以誘導(dǎo)MDM2的選擇性剪接， 但是只有蒽環(huán)類的藥物可以誘導(dǎo)MDM2剪切體表達(dá)， 而其他化療藥物比如Hu和5-Fu并不能引起MDM2的選擇性剪切。蒽環(huán)類藥物主要包括Dox、表阿霉素、柔紅霉素和伊比沙星等廣泛地用于治療血液病和實(shí)體腫瘤， 比如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等[23]。蒽環(huán)類藥物優(yōu)點(diǎn)是具有抗瘤廣譜性， 抗瘤能力強(qiáng)， 療效好。但是引起的不良反應(yīng)較嚴(yán)重， 主要是脫發(fā)和心臟毒性[24]。其作用機(jī)理主要是通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間， 形成穩(wěn)定復(fù)合物， 抑制DNA復(fù)制與RNA合成， 從而阻礙快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞的分裂[25]。Hu[26]和5-Fu[27]的作用機(jī)理不同于蒽環(huán)類藥物， 在體內(nèi)主要是引起DNA的單鏈斷裂， 影響DNA和RNA的生物合成， 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這也許解釋了為何只有蒽環(huán)類藥物可以誘導(dǎo)MDM2的選擇性剪切， 接下來會(huì)深入研究具體的原因。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了MDM2的RNA新的剪切體， 通過測(cè)序解析了插入序列， 在10號(hào)外顯子后插入了終止密碼子， 阻斷了MDM2的轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)的合成。MDM2的11號(hào)和12號(hào)外顯子編碼的蛋白是E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域， 當(dāng)MDM2失去E3泛素連接酶活性時(shí)， 就不能夠降解P53， 丟失了對(duì)P53的調(diào)控作用。本研究能夠更好的理解MDM2-P53通路復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制， 并對(duì)靶向MDM2的化療藥物的開發(fā)具有重要的影響。

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[收稿日期：2018-06-29]