王娜妮 許平翠 張 揚(yáng) 壽 旦

浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

骨髓炎具有病程長、反復(fù)發(fā)作、易致殘等特點(diǎn)，是骨科復(fù)雜病種。淫羊藿-仙茅是常用治療骨病的溫補(bǔ)腎陽藥對(duì)，能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長，修復(fù)骨缺損。本研究采用骨髓炎兔模型，研究淫羊藿和仙茅配伍前后有效成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為變化，探討藥對(duì)配伍協(xié)同增效的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性新西蘭兔，3月齡，體質(zhì)量為2.2±0.1kg，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（浙）2017-0009。

1.2 藥品：淫羊藿、仙茅飲片購自華東醫(yī)藥公司，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院俞忠明副主任中藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.的干燥葉和石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根莖。對(duì)照品淫羊藿苷（純度≥98%，批號(hào)：489-32-7）、朝藿定A（純度≥98%，批號(hào)：MUST-12062311）、朝藿定B（純度≥98%，批號(hào)：MUST-12062312）、朝藿定C（純度≥98%，批號(hào)：MUST-12062313）、仙茅苷（純度≥98%，批號(hào)：85643-19-2）、苔黑酚葡萄糖苷（純度≥98%，批號(hào)：15072213）均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑與儀器：甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merk公司）；生理鹽水（批號(hào)：A16032301）購自浙江科倫制藥有限公司。其他試劑均為分析純。Xevo TQD超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國Waters）；Smart2Pure UV/UF超純水儀（美國Thermal fisher）；AE240電子天平（瑞士Mettler）；Microfuge 20R離心機(jī)（美國Beckman coulter）；Lab dancer S25渦旋振蕩混合器（德國Ika）。

1.4 藥對(duì)及單味藥材提取物的制備：取淫羊藿、仙茅各10g，混合，加藥材重量20倍量的水，煎煮1h，濾過，藥渣加20倍量的水，煎煮1h，濾過，合并2次煎煮液，濃縮至生藥含量為淫羊藿和仙茅各1.5g/ml的水提液。取淫羊藿、仙茅藥材各10g，分別單煎，加水量、煎煮次數(shù)及方法同藥對(duì)水提液制備方法，制備生藥含量均為1.5g/ml的淫羊藿水提液及仙茅水提液。

1.5 骨髓炎兔模型制備及分組：參照課題組前期已建立的造模方法[1]，進(jìn)行造模手術(shù)，術(shù)后4周驗(yàn)證模型。造模成功的骨髓炎兔隨機(jī)分為：模型組、淫羊藿組、仙茅組、藥對(duì)組，每組3只。

1.6 給藥及血漿制備：除模型組外，其余各組采用清創(chuàng)手術(shù)-局部抗炎-灌胃給藥治療方案：按50mg/只的萬古霉素給藥劑量，病灶局部置入載萬古霉素硫酸鈣。淫羊藿組給予6g/kg/d淫羊藿提取液，仙茅組給予6g/kg/d仙茅提取液，藥對(duì)組給予6g/kg/d淫羊藿+6g/kg/d仙茅的藥對(duì)提取液。另取正常動(dòng)物設(shè)空白對(duì)照組。給藥前12h禁食，自由飲水，給藥后8h統(tǒng)一禁食。連續(xù)灌胃給藥5d。第5d灌胃后，分別在后0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、10.0、20.0、30.0h，兔耳緣靜脈取血0.3ml，將血液置入裝有肝素鈉抗凝的離心管中，4℃下5000rpm迅速離心10min，取上清液即為含藥血漿。

1.7 血漿藥物濃度檢測(cè)：分述如下。

1.7.1 血漿樣品預(yù)處理：精密量取血漿100μl，加入500μl乙腈漩渦混勻，5000rpm離心10min，上清液氮?dú)獯蹈桑?00μl流動(dòng)相[0.1%甲酸乙腈（A)∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)]復(fù)溶，12000rpm離心10min，取上清液待色譜分析。

1.7.2 對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱取6種對(duì)照品適量，分別用乙腈溶解配置為質(zhì)量濃度為1mg/ml的母液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前分別精密吸取一定量的對(duì)照品母液，用流動(dòng)相[0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B）=24∶76（v/v）]稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml的對(duì)照品溶液。

1.7.3 液相色譜條件：Capcell C18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl，流速1.0ml/min。

流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)，檢測(cè)波長270nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 色譜分析和方法學(xué)考察：取7份100μl空白血漿，加入不同質(zhì)量濃度的100μl混標(biāo)溶液，按1.7.1項(xiàng)下方法操作，在1.7.3項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。6個(gè)主要有效成分線性范圍均為0.0100-10.0000μg/ml，回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）：苔黑酚葡萄苷：Y=0.0018X+0.0025，r=0.9993；仙茅苷：Y=0.0716X+0.0025，r=0.9994；朝藿定A：Y=0.2345X+0.0041，r=0.9993；朝藿定B：Y=0.2634X+0.0350，r=0.9997；朝藿定 C：Y=0.1611X+0.0625，r=0.9999；淫羊藿苷：Y=0.0356X-0.0201，r=0.9998。該方法的日內(nèi)和日間精密度RSD（n=6）均小于5%，血漿經(jīng)冷藏（－80℃、3d）和反復(fù)凍融（3次）后各成分RSD（n=3）均小于10%，平均加樣回收率均在85%～105%之間，符合檢測(cè)要求。

2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算和分析：淫羊藿和仙茅配伍前后給藥各成分在骨髓炎兔體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。血藥濃度數(shù)據(jù)采用藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件3p97擬合，采用非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，灌胃淫羊藿仙茅水提物后，各有效成分在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

圖1 淫羊藿仙茅藥對(duì)主要有效成分HPLC色譜圖

圖2 淫羊藿仙茅藥對(duì)給藥后各成分的藥時(shí)曲線

表1 淫羊藿和仙茅配伍前后淫羊藿苷和仙茅苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

3 討論

骨髓炎合并有死骨形成、成骨活性下降、局部血液循環(huán)差等問題，是病灶清除后骨缺損難以修復(fù)的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)抗生素植入技術(shù)結(jié)合淫羊藿、仙茅口服給藥有較強(qiáng)的抗感染能力和較好的成骨活性，能在病灶徹底清除后，有效發(fā)揮骨修復(fù)作用。中藥配伍可以影響有效成分在體內(nèi)的吸收和代謝。淫羊藿和仙茅均可溫補(bǔ)腎陽，相須為用，相得益彰。本實(shí)驗(yàn)研究了淫羊藿仙茅配伍前后6種主要有效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、苔黑酚葡萄糖苷、仙茅苷在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)配伍顯著影響其在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，使其血藥濃度增加，體內(nèi)清除速率減慢，生物利用度增加，從而促進(jìn)藥物進(jìn)入病變部位，延長藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，發(fā)揮協(xié)同增效作用。從藥動(dòng)學(xué)角度闡明了仙茅和淫羊藿配伍治療骨髓炎骨不連的合理性。