劉麗 ，孫愛猛 ，羅青 ，朱端昊 ，李健雄 ，施勇 ，周信云 ，馮萍英 ，羅瀅娟

(1、吉安市疾病預(yù)防控制中心，江西 吉安 343000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

乙型流感病毒是引起人流行性感冒的重要病原，致病性較強，人普遍易感，只在人間傳播，常呈暴發(fā)或小流行。其在世界范圍內(nèi)多個國家都有過流行，我國在1994年、1997年、和2000年出現(xiàn)乙流高峰，2005年呈引起小規(guī)模暴發(fā)[1]，近年來我市監(jiān)測的流感樣病例陽性標本中，乙型流感病毒占居較大比例，2016年為我市優(yōu)勢型別，且在2016年3月及2017年12月均出現(xiàn)過乙型流感病毒引起的局部流行。流感病毒的抗原漂移性強，易發(fā)生變異，及時正確掌握流感流行及變異趨勢，對預(yù)防和控制流感大流行具有重要的作用。本文通過對吉安市2016年-2017年分離到的乙型流感病毒的HA（血凝素）和NA（神經(jīng)氨酸酶）進行基因測序，分析其系統(tǒng)進化及分子變異特征，了解乙型流感病毒的基因特點，為吉安市流感流行的防控工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇我市2016年-2017年不同時間段的流感樣病例監(jiān)測及疑似流感疫情咽拭標本中分離到的乙型流感病毒，進行基因擴增和測序。

1.2 病毒RNA提取采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit對選取的乙型流感病毒毒株進行病毒RNA提取，具體步驟參考試劑說明書。

1.3 引物 基因測序引物序列參考WHO[2]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 基因RT-PCR擴增 擴增采用Qiagen One Step RT-PCR Kit試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)，RT反 應(yīng) 條 件 ：60℃ ，1min；42℃ ，10min；50℃ ，30mm；95℃，15min，PCR 循 環(huán) 條 件 ：94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min，循環(huán) 35 次，72℃ 10min。

1.5 核苷酸序列測定PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向測定。

1.6 序列分析采用DNAStar5.0、Mage6.0軟件對測序結(jié)果進行拼接及分析。從Influenza Sequence Database中下載B/Brisbane/60/2008（2016年-2018年度疫苗株，Victoria 系，CY115151，CY115153），B/Phuket/3073/2013（2016年-2018年度疫苗株，Yamagata 系，EPI544264，EPI544263）HA 和 NA 基因序列作為參比序列進行分析。

2 結(jié)果

2.1 2016年-2017年吉安市乙型流感基因亞型分布2016年-2017年吉安市流感監(jiān)測樣本中乙型流感占一定比例，2016年乙型流感病毒的陽性率超過甲型流感，占 51.3%；2017年有所降低，占29.6%；病毒培養(yǎng)結(jié)果顯示本市2016年乙型流感病毒主要為Bv系，占乙型流感病毒培養(yǎng)陽性總數(shù)的89.2%，2017年主要為BY系，占該年乙型流感病毒培養(yǎng)陽性總數(shù)的71.7%。

表1 2016年-2017年吉安市乙型流感病毒核酸檢測及病毒分離情況

2．2 乙型流感病毒序列測定 選取乙型流感病毒2016年的毒株11株 （6株Victoria系，5株Yamagata系），2017年的毒株 4株（2株 Victoria系，2株Yamagata系）進行HA和NA基因。15株病毒的HA、NA基因擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、雙向測序、序列拼接后，Victoria系B型流感病毒獲得1758bp HA基因序列和1401bp NA基因序列，Yamagata系B型流感病毒獲得1401bp HA基因序列和1041bp NA基因序列，所有毒株序列均未發(fā)現(xiàn)核苷酸的丟失和插入。

2．3 HA基因特征分析

2．3．1 核苷酸同源性 8株 Victoria系 B型毒株HA 基因之間的同源性為 99．3%～99．9%，7株 Yamagata系乙型毒株HA基因之間的同源性為98．8%～99．8%。 HA 基因核苷酸進化樹（見圖 1）上顯示，8株Victoria系B型毒株HA基因均為同一分支，且與疫苗株B/Brisbane/60/2008處于同一分支，同源性為 98．7%～99．0%。7株 Yamagata系 B 型毒株 HA基因均為同一分支，與疫苗株B/Phuket/3073/2013處于同一分支，同源性為 99．1%～99．5%。

圖1 HA基因進化樹

2．3．2 與WHO推薦疫苗株在HA1區(qū)域氨基酸序列的比較 2016年－2018年 WHO北半球 B型Victoria系流感疫苗推薦株為B/Brisbane/60/2008，本研究的8株Victoria系毒株HA1氨基酸變異較小，與其的差異數(shù)為2～3個，分別有1株毒株發(fā)生172P＞S、189T＞A 變異，7 株毒株發(fā)生 117I＞V 變異、并且全部發(fā)生了129N＞D變異，其中117位和129位均位于抗原決定簇上。

與乙型Yamagata系流感疫苗推薦株B/Phuket/3073/2013相比，本研究的7株Victoria系毒株HA1氨基酸變異較小，與其的差異數(shù)為1－4個 ， 分 別 為 56D＞N、137L＞I、150I＞V、172L ＞Q、196D＞N、211K＞R、251M＞V、278R＞K， 其中 8 株毒株均在172、251、278位發(fā)生了變異。137位和150位位于抗原決定簇上，且該處變異發(fā)生于同一毒株（B/JiangxiJizhou/1306/2016）。

2．4 NA 基因特征分析

2．4．1 核苷酸同源性 8株Victoria系乙型毒株NA基因之間的同源性為 99%～99．8%，7株Yamagata系乙型毒株 NA基因之間的同源性為 98．3%～99．9%。NA基因核苷酸進化樹（見圖2）上顯示，8株Victoria系乙型毒株NA基因均為同一分支，且與疫苗株B/Brisbane/60/2008處于同一分支，同源性為 98．7%～99．1%。7 株 Yamagata系乙型毒株 HA基因均為同一分支，與疫苗株B/Phuket/3073/2013處于同一分支，同源性為99%～99．6%。

圖2 NA基因進化樹

2．4．2 NA基因耐藥性位點分析 與乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感株B/JiangxiJizhou/1306/2016相比，本研究的15株毒株NA基因酶催化活性位點 (R－116、D－149、R－150、R－223、E－275、R－292、R－374 和 P－406)氨基酸和輔助位點(E－117、R－154、W－177、S－178、D－197、I－221、E－226、H－273、E－276和 N－294，E－428 位) 氨基酸均未發(fā)生替 換 。 對 E105、G108、G141、N144、S249、T325、R374、G407等其他位點進行分析，均未發(fā)生氨基酸替換。

3 討論

乙型流感病毒1940年在美國的一次流感中首次被檢出，為單股負鏈分節(jié)段帶包膜的RNA病毒[3]，1983年以來根據(jù)其基因特征和抗原性的不同分成兩大譜系，分別為Yamagata系和Victoria系[4]。2016年－2017年我市監(jiān)測流感樣病例陽性標本中，乙型流感病毒占居較大比例，且2016年為我市優(yōu)勢病毒株，2016年－2017年吉安市B型流感病毒分離情況表明，我市人群中流行的乙型流感毒株中 2016年以 Victoria系為優(yōu)勢，2017年以Yamagata系為優(yōu)勢。

乙型流感病毒在復(fù)制過程中易發(fā)生基因變異，通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變方式引起抗原性改變，乙型流感病毒基因組分8個節(jié)段編碼11種蛋白，其中RNA4與RNA6分別編碼血凝素（HA）及神經(jīng)氨酸酶（NA），血凝素（HA）變異最大，乙型流感病毒和甲型一樣都是依靠病毒外膜蛋白，尤其是血凝素的重鏈HA1的變異，改變抗原特性，逃避抗體已有的免疫保護，導(dǎo)致流感流行[5－8]。目前，已知的B型流感病毒HA1蛋白分子的抗原決定簇主要包括了4個區(qū)域，分別是：120環(huán) (116～137)、150 環(huán) (141～150)、160 環(huán) (162～170) 和 190 螺旋（197～205），其中 Victoria系的120環(huán)還包括了 75和77兩個位點[9]，這些位點氨基酸的改變，會引起病毒抗原性發(fā)生改變[10]。本研究的8株Victoria系流感毒株與疫苗株相比在120環(huán)上發(fā)生了兩處變異，提示我市2016年－2017年Victoria系可能發(fā)生了抗原性的改變，有可能會導(dǎo)致疫苗的保護作用減弱，從而導(dǎo)致流感的流行，這與我市2016年Victoria系流行可能存在一定的關(guān)系。但一般認為，一個具有流行病學(xué)意義的新變種必須具備，在其血凝素重鏈(HA1)區(qū)蛋白分子上，至少有4個以上氨基酸發(fā)生了替換，而且這4個替換必須分布在兩個以上抗原決定簇區(qū)[11]。

神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAIs)為乙型流感的特效治療藥物，其藥物靶點為神經(jīng)氨酸酶，因為它不僅在病毒傳播中發(fā)揮重要的抑制作用，而且其酶催化活性位點氨基酸以及周圍的輔助氨基酸非常保守。流感病毒神經(jīng)氨酸酶的8個氨基酸(R－116、D－149、R－150、R－223、E－275、R－292、R－374 和 P－406)作為酶催化活性位點直接作用底物或者作為維持功能的重要因素，而其他11個氨基酸(E－117、R－154、W－177、S－178、D－197、I－221、E－226、H－273、E－276 和 N－294，E－428 位) 作為輔助位點[12]。NA抑制劑作用于酶催化活性位點或輔助位點[13]，可以有效地阻斷流感病毒感染、復(fù)制和傳播的過程。目前美國FDA批準的NAIs有Oseltamivir和Zanamivir，我國2002年批準了Oseltamivir在我國注冊，然而隨著NAIs的臨床使用，耐藥株將不可避免的出現(xiàn)。許多研究人員從臨床研究中發(fā)現(xiàn)分離自NAIs治療的病人標本的流感病毒出現(xiàn)耐藥位點的突變[14，15]，這些研究都提示B型流感NA的耐藥位點的多樣性和耐藥病毒株越來越多的涌現(xiàn)。

本次研究并未發(fā)現(xiàn)我市乙型流感毒株HA基因抗原性發(fā)生較大的變異和NA基因耐藥位點的變異，但是乙型流感病毒抗原性和耐藥性監(jiān)測應(yīng)予以長期、持續(xù)的加強，以期及時在監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)有意義的變異，為本市流感的預(yù)防和控制提供技術(shù)支持。