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        呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者下呼吸道標(biāo)本檢出的粘質(zhì)沙雷菌β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)及同源性分析

        2018-12-21 04:40:48陳曉香許青霞盛家和
        關(guān)鍵詞:內(nèi)酰胺酶頭孢性肺炎

        陳曉香,許青霞,盛家和

        (鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 鄭州450000)

        呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎 (ventilator-associated pneumonia,VAP)是重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)機(jī)械通氣患者最常見(jiàn)的感染性疾病之一,可導(dǎo)致患者住院時(shí)間和ICU留治時(shí)間延長(zhǎng),抗菌藥物使用增加,重癥患者病死率增加[1],因此遏制VAP已成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)需要迫切解決的問(wèn)題[2]。目前,常引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等多有文獻(xiàn)論述[1,3],但粘質(zhì)沙雷菌引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎鮮有報(bào)道,故本文連續(xù)多年收集相關(guān)患者下呼吸道標(biāo)本分離的粘質(zhì)沙雷菌,研究其藥物敏感性特征、主要β-內(nèi)酰胺酶的基因型及是否存在粘質(zhì)沙雷菌在患者之間的傳播,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀為美國(guó)BD公司PhoenixTM-100,PCR預(yù)混液、細(xì)菌DNA提取試劑盒、引物合成等來(lái)自上海生物工程技術(shù)有限公司,脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,E-test試紙條購(gòu)自安圖生物。

        1.2 菌株來(lái)源及其鑒定和藥敏 2015年3月1日至2017年3月1日,連續(xù)收集我院重癥監(jiān)護(hù)病房明確診斷為呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者下呼吸道標(biāo)本分離的粘質(zhì)沙雷菌。下呼吸道標(biāo)本的臨床檢驗(yàn)方法均嚴(yán)格參照《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]和《下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南》[5]。呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)遵照 《中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)的診療指 南 》 和 規(guī) 范[1,6]。 質(zhì) 控 菌 株 為 大 腸 埃 希 菌ATCC25922、沙門菌H9812。所有粘質(zhì)沙雷菌的鑒定和最小抑菌濃度測(cè)定均使用PhoenixTM-100,并用E-TEST條驗(yàn)證,判讀標(biāo)準(zhǔn)均參考CLSI2016年1 月 M100-S26[7]。

        1.3 β-內(nèi)酰胺酶基因型確證實(shí)驗(yàn) 試劑盒提取菌株基因組DNA為模板,引物及擴(kuò)增條件均參考相關(guān)文獻(xiàn)[8],詳見(jiàn)表1。其余β內(nèi)酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaFOX、blaOXA、blaCTX-M-2、blaCTX-M group 8/25、blaMOX、blaDHA、blaCMY1-23、blaACT-1和blaMIR等擴(kuò)增條件、引物均參考文獻(xiàn)[9]。如擴(kuò)增陽(yáng)性,產(chǎn)物直接純化后測(cè)序,結(jié)果在GenBank上比對(duì)以確定基因型。

        1.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳及指紋圖譜聚類分析 菌株在LB肉湯中過(guò)夜震蕩,菌液和2%的低熔點(diǎn)膠灌模,然后使用0.8g/L蛋白酶K消化24h,后使用TE洗膠及XbaⅠ37℃酶切過(guò)夜,并埋入1%瓊脂糖凝膠電泳,切換時(shí)間為2.16-63.8s,電場(chǎng)強(qiáng)度是6V/cm,電場(chǎng)夾角是 120°,電泳時(shí)間是 18.5h,最后用溴化乙錠染色紫外燈成像,判讀參考Tenover等人的標(biāo)準(zhǔn)[10]。

        2 結(jié)果

        2.1 菌株及藥敏 共收集粘質(zhì)沙雷菌67株。藥敏結(jié)果顯示,粘質(zhì)沙雷菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的敏感率均為100%,其次哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等 的 敏 感 率 分 別 為 97.59% 、96.18% 、93.27% 、85.07%、82.13%,但對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等敏感率均低于50%。其中對(duì)頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥的10株粘質(zhì)沙雷菌具體耐藥譜見(jiàn)表2。

        2.2 β-內(nèi)酰胺酶表型和基因型確證實(shí)驗(yàn) ESBLs表型實(shí)驗(yàn)證實(shí),此10株粘質(zhì)沙雷菌β-內(nèi)酰胺酶表型均為陽(yáng)性。擴(kuò)增顯示,在約561bp處均有清晰條帶,測(cè)序比對(duì)的結(jié)果顯示,均為CTX-M-14(詳見(jiàn)圖1),DNA 序列一致率均為 100%;1-5、7、10 在約895bp處有清晰條帶,測(cè)序證實(shí)均為CMY-1(詳見(jiàn)圖2),DNA序列一致率均為100%。其余均為陰性。

        圖1 CTX-M-14基因PCR擴(kuò)增電泳圖(M為Marker)

        表1 PCR擴(kuò)增引物

        表2 10株粘質(zhì)沙雷菌的最小抑菌濃度(μg/ml)

        2.3 同源性分析 菌株 1、2、5的條帶的差異小于兩條,表明此三株菌具有同源性,菌株3和4具有完全相同的條帶,表明兩株具有同源性,其余菌株均沒(méi)有同源性(詳見(jiàn)圖3)。

        圖2 CMY-1基因PCR擴(kuò)增電泳圖(M為Marker)

        圖3 Xbal酶切后的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖

        3 討論

        粘質(zhì)沙雷菌通常存在水和土壤中,被認(rèn)為是院內(nèi)感染的重要病原菌,可引起肺部、血流和泌尿系統(tǒng)感染等,嚴(yán)重的會(huì)引起院內(nèi)感染的爆發(fā),特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房。從2015年3月1日至2017年3月1日,我院發(fā)生多起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎,其下呼吸道標(biāo)本均分離出粘質(zhì)沙雷菌。藥敏情況統(tǒng)計(jì)表明,我院下呼吸道分離的粘質(zhì)沙雷菌沒(méi)有碳青霉烯類抗生素耐藥株,對(duì)三代頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等都具有較好的敏感率,優(yōu)于2016年CHINET統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)[11];但對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等耐藥率較高,此與CHINET數(shù)據(jù)基本一致[11]。

        β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)表明,有10株粘質(zhì)沙雷菌對(duì)頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥,均檢出CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。CTX-M是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶,包含多個(gè)快速增長(zhǎng)的亞群,具有臨床重要的意義[12]。CTX-M基因在世界各地的不同菌株均有檢出,但不同地區(qū)流行的ESBLs的基因型或亞型有一定差異,如歐洲以CTX-M-1群為主,亞洲國(guó)家以 CTX-M-9 群為主[12,13]。 CTX-M-14 是CTX-M-9群的一種,在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌中均有檢出。

        除了CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶外,還發(fā)現(xiàn)了有七株細(xì)菌同時(shí)產(chǎn)CMY-1型AmpC酶。CMY-1在國(guó)內(nèi)極少有文獻(xiàn)報(bào)道,僅國(guó)外有限的文獻(xiàn)報(bào)道多在家禽和寵物分離的粘質(zhì)沙雷菌CMY-1[14],另有韓國(guó)的文獻(xiàn)報(bào)道,367株粘質(zhì)沙雷菌中,CMY-1的檢出率為2.5%[15,16],其他細(xì)菌包括腸桿菌科的細(xì)菌中,極少檢出CMY-1。本文在臨床標(biāo)本中,連續(xù)在多株粘質(zhì)沙雷菌中,發(fā)現(xiàn)CMY-1型AmpC酶基因,其基因周圍序列的特征對(duì)于研究CMY-1基因的進(jìn)化規(guī)律或重組過(guò)程有著重要的意義。

        同源性分析的結(jié)果顯示,菌株1、2和5具有典型的同源性。追蹤其病歷發(fā)現(xiàn),此三株細(xì)菌均來(lái)自我院ICU病區(qū)三位不同的患者,均為2016年8月份入院,分別接受了膀胱腫瘤切除術(shù)、陰莖癌腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)和直腸癌術(shù)后放療后入住ICU病區(qū),均為機(jī)械通氣后48h出現(xiàn)體溫升高,白細(xì)胞增多等現(xiàn)象,最高體溫至39℃左右,WBC均在20.5×109/L以上,下呼吸道標(biāo)本涂片低倍鏡下每視野WBC大于25個(gè),伴隨大量的革蘭陰性桿菌并吞噬,鑒定為粘質(zhì)沙雷菌。菌株3和4為2016年5月份入院,均為多器官功能衰竭入住ICU病區(qū),去除呼吸機(jī)后4-5h出現(xiàn)感染癥狀,下呼吸道標(biāo)本也分離獲得粘質(zhì)沙雷菌。結(jié)果表明,同時(shí)產(chǎn)CMY-1和CTX-M-14的粘質(zhì)沙雷菌1、2和5可能是我院傳播的克隆株,而菌株3和4可能是我院傳播的另一克隆株。追蹤以上克隆株傳播的路徑有待進(jìn)一步研究。

        總之,通過(guò)本文的研究發(fā)現(xiàn),我院引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的粘質(zhì)沙雷菌對(duì)碳青霉烯類、氨基糖苷類和部分抗生素類仍保持較高的敏感性,但少部分菌株可通過(guò)攜帶CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶或CMY-1型AmpC酶導(dǎo)致對(duì)三代頭孢耐藥;尤為重要的是,部分患者存在院內(nèi)粘質(zhì)沙雷菌克隆傳播的可能,因此合理使用抗生素,做好院內(nèi)多重耐藥菌的防控極其重要。

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