韋中陽，侯桂紅

(1、安陽市人民醫(yī)院骨一科，河南 安陽 455000；2、洛陽正骨醫(yī)院（骨科醫(yī)院）頸腰痛二科，河南 洛陽 471002)

腰 椎 間 盤 突 出 癥 （Lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見的脊柱退行性疾病，椎間盤纖維環(huán)破裂后，突入椎管內(nèi)的髓核、殘留的纖維環(huán)覆蓋在后縱韌帶上，壓迫鄰近神經(jīng)根，誘發(fā)一系列的臨床病癥[1]。該疾病的發(fā)病機制尚未明確，臨床發(fā)現(xiàn)除生物化學因素外還可能存在細胞因子的作用。解聚蛋白酶－12(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 12，ADAMTS－12) 是一類Zn2+依賴的分泌性金屬蛋白酶家族成員，在維持凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、器官生成、炎癥與生育方面具有重要作用，能夠有效分解明膠，降解膠原溶解物，在椎間盤退變過程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究對腰椎骨折椎間盤與退行腰椎間盤進行組織學觀察，并分析ADAMTS－12在退變腰椎間盤組織中的表達，以進一步探索椎間盤退變的發(fā)病機制，報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2015年2月至2017年2月在我院治療的腰椎間盤突出患者的椎間盤標本54例，納入標準：⑴均經(jīng) CT、MRI等檢查確診[3]，其中MRI示TW2髓核信號變低；⑵均在我院行手術(shù)髓核切除；⑶患者臨床病理資料保存完整。排除標準：合并有類風濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病。其中男性30例，女性24例；年齡35～69歲，平均年齡（46．28±9．28）歲；椎間盤節(jié)段：L3－4 椎間盤突出患者7例，L4－5椎間盤突出患者34例，L5－S1椎間盤突出患者13例。根據(jù)術(shù)中觀察及北美脊柱協(xié)會[4]分類進行分組，其中后外層纖維環(huán)破裂 （指突出椎間盤組織完全穿破外層纖維環(huán)和后縱韌帶復合物，并進入椎管內(nèi)）32例，后外層纖維未破裂 （指椎間盤局部突出區(qū)域在外層纖維環(huán)和后縱韌帶復合物內(nèi)）22例。同時選取同期在我院治療的腰椎骨折并接受椎體融合術(shù)的患者腰椎間盤組織40例（對照組），其中男性25例，女性15例；年齡 37～72 歲，平均年齡（47．04±10．24）歲；椎間盤節(jié)段：L3－4椎間盤突出患者5例，L4－5椎間盤突出患者29例，L5－S1椎間盤突出患者6例。

1．2 MRI檢 測 所 有 患 者 采 用 GE 1．5T Signa TwinSpeed with excite雙梯度超導型磁共振掃描儀進行MRI掃描，相控陣頭線圈完成對腰椎間盤的掃描，MRI掃描時以橫軸位為主，矢狀為輔，進行平掃、動態(tài)增強與減影成像，層間距為0．5mm，層厚度為5mm。

1．3 HE染色 ⑴標本固定：將采集的髓核組織制作成標本，固定在4%甲醛固定液6～10h。⑵沖洗、脫水、滲透：使用流水沖洗固定液后，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明。⑶組織包埋：預熱好的石蠟倒入蠟槽內(nèi)，將放好的組織自然冷卻，修整蠟塊。⑷裱片：取一清潔載玻片，涂一層蛋白甘油，在水中撈取切好的蠟片，擺正蠟片，放入格盤中，在64℃溫箱中烘干。⑸切片染色：二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，使用自來水沖洗。⑹蘇木精染色：浸泡7min蘇木精染液，染細胞核，自來水沖洗3～5min。⑺1%鹽酸乙醇分化1－5s，自來水沖洗1～3min。⑻弱堿性水溶液返藍30s～1min，自來水沖洗5～10min。⑼伊紅染色：浸泡伊紅染色液1－5s，染細胞質(zhì)。⑽梯度乙醇脫水、二甲苯透明。⑾中性樹膠封片。

1．4 免疫組化檢測 ⑴脫蠟、水化：切片浸泡二甲苯5min 2次，梯度酒精水化，自來水沖洗，PBS沖洗2次，5min/次。⑵微波熱修復。切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10min，蒸餾水洗 2min×3。 將切片放入盛有 0．01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6．0）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃～98℃之間并持續(xù)10～15min。取出容器，室溫冷卻10～20min。⑶3%H2O2（80%甲醇）滴加切片上，室溫靜置10min。⑷PBS沖洗2～3次。⑸滴加山羊血清封閉液，室溫放置20min后滴加第一抗體，4℃過夜后需在37℃復溫45min。⑹切片上滴加生物素化第二抗體 （IgG）， 室溫放置 20min，PBS沖洗 3次，5min/次。⑺滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（SA/HRP），37℃ 20min，PBS 沖洗 3 次，5min/次。⑻DAB顯色1～3min，在顯微鏡下掌握染色程度。⑼蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15min。⑽乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片、鏡檢。

1．5 聚合酶鏈反應 （PCR） 設(shè)置上游引物：5'－CAC－TTGACTGGGTTCCTA－3'； 下游引物：5'－CTCATTCCCGTTCCTCT－3'，擴增片段長度為 1096bp。PCR 擴增體系：10×緩沖液 2．5ul，Mg2+1．0ul（25mol/L），Mix dNTP0．5ul （10mmol/L）， 上、 下游引物各0．5ul （20umol/L），Taq DNA 聚合酶 0．25ul，DNA 模板 1．0ul， 加入雙蒸水至 25ul。PCR反應條件為95℃預變性 2min，94℃變性 45s，51℃退火 1min，72℃延伸 1min，循環(huán) 35次，72℃延伸 10min，4℃維持終止。采用ABI3100測序儀進行檢測分析。

1．6 結(jié)果判斷 ADAMTS－12蛋白在椎間盤髓核組織細胞的胞漿中表達，根據(jù)染色強度分為：無著色為－，淺棕黃色為+，棕黃色為++，深棕黃色為+++，其中++～+++為陽性表達，－～+為陰性表達。椎間盤退變在MRI T2加權(quán)像上按Pearce分級標準[5]分為5級，等級越高，表明椎間盤退變越嚴重，其中Ⅰ～Ⅱ級為正常椎間盤，Ⅲ～Ⅴ級為退變椎間盤。

1．7 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 19．0軟件，計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，以P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 椎間盤髓核組織HE染色 正常腰椎間盤髓核細胞呈卵圓形，存在不規(guī)則的軟骨陷窩，偶可見少量的細胞團及多核巨細胞，見圖1A，退變髓核細胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，出現(xiàn)軟骨細胞的“網(wǎng)巢狀”結(jié)構(gòu)，見圖1B。

圖1 腰椎間盤髓核組織HE染色（×400，A：正常組織；B：退變組織）

2．2 ADAMTS－12蛋白在腰椎間盤髓核組織中的表達 后外層纖維環(huán)破裂患者ADAMTS－12蛋白陽性表達率明顯高于后外層纖維環(huán)未破裂患者和對照組 （P＜0．05）； 后外層纖維環(huán)未破裂患者ADAMTS－12蛋白陽性表達率明顯高于對照組（P＜0．05）。 見表 1 和圖 2。

表1 ADAMTS-12蛋白在腰椎間盤髓核組織中的表達

2．3 ADAMTS－12 mRNA 在腰椎間盤髓核組織中的表達 后外層纖維環(huán)破裂患者ADAMTS－12 mRNA 表達為（0．812±0．048），明顯高于后外層纖維環(huán)未破裂患者和對照組（P＜0．05）；后外層纖維環(huán)未破裂患者 ADAMTS－12 mRNA表達為 (0．521±0．037)，明顯高于對照組（P＜0．05）。見表 2。

表2 ADAMTS-12 mRNA在腰椎間盤髓核組織中的表達

2．4 不同 MRI分級髓核組織 ADAMTS－12 mRNA表達 MRI分級為Ⅴ級組織ADAMTS－12 mRNA表達為（0．901±0．042），明顯高于Ⅲ級和Ⅳ級組織（P＜0．05）； Ⅳ級組織 ADAMTS－12 mRNA 表達為（0．703±0．040），明顯高于Ⅲ級組織（P＜0．05）。 見表3。

表3 不同MRI分級髓核組織ADAMTS-12 mRNA表達

3 討論

正常人體的椎間盤具有彈性大、緩沖沖擊力強的特征，能夠承受較大壓力負荷，但隨著年齡增大或屈伸、擠壓、扭轉(zhuǎn)等外力作用，椎間盤發(fā)生退行性變，誘發(fā)纖維環(huán)破裂，出現(xiàn)椎間盤病變[6，7]。腰椎間盤突出是臨床骨科常見病，其發(fā)病機制較為復雜，不僅僅是形態(tài)學上的變化，同時還伴有組織學與生化性質(zhì)變化，蛋白多糖與水含量減少、膠原類型轉(zhuǎn)化、降解酶活性升高與炎癥介質(zhì)大量釋放，這一系列變化最終導致椎間盤源性腰背部疼痛與神經(jīng)根病變[8，9]。

臨床研究指出，髓核50%成分為聚集蛋白聚糖，ADAMTS－12為這一類解聚蛋白聚糖酶，可以降解髓核組織，抑制軟骨細胞分化，誘發(fā)髓核退變[10]。ADAMTS－12在髓核細胞退變衰老過程中發(fā)揮重要作用，其水平變化與髓核退變間的關(guān)系已成為臨床研究的熱點[11]。

ADAMTS－12是臨床發(fā)現(xiàn)的一種解聚蛋白聚糖酶，由血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等多種細胞分泌合成，分子量為177．5KD[12，13]。 ADAMTS－12 羥基端血小板反應蛋白可結(jié)合軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）表皮生長因子樣功能區(qū)，加強纖維連接蛋白、蛋白多糖、膠原蛋白的聯(lián)系，發(fā)揮穩(wěn)定軟骨細胞外基質(zhì)的作用[14，15]。本研究通過椎間盤髓核組織HE染色發(fā)現(xiàn)，正常腰椎間盤髓核細胞呈卵圓形，存在不規(guī)則的軟骨陷窩，偶可見少量的細胞團及多核巨細胞，退變髓核細胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，出現(xiàn)軟骨細胞的“網(wǎng)巢狀”結(jié)構(gòu)，這些表現(xiàn)佐證了上述分析，同時也提示ADAMTS－12表達增強可作為椎間盤發(fā)生退變的重要標志之一。

本研究采用免疫組織化學方法檢測腰椎間盤組織ADAMTS－12與ADAMTS－12 mRNA的表達，結(jié)果提示，腰椎間盤髓核組織中ADAMTS－12蛋白陽性表達率為：后外層纖維環(huán)破裂＞后外層纖維環(huán)未破裂＞對照組，這說明ADAMTS－12的確參與了患者腰椎間盤組織退變的病理過程，臨床應定期檢查腰椎間盤組織中ADAMTS－12水平，并高度重視ADAMTS－12水平升高者，及時對其采取相應的治療措施，改善預后。為進一步明確ADAMTS－12與退行性腰椎間盤組織的關(guān)系，本研究觀察ADAMTS－12 mRNA在不同MRI分級髓核組織中的表達為V級＞Ⅳ級＞Ⅲ級，這表明ADAMTS－12不僅參與了腰椎間盤突出的發(fā)病過程，其水平隨著腰椎間盤組織退變程度而不斷升高。

綜上所述，退變腰椎間盤組織中ADAMTS－12的表達不同于腰椎骨折椎間盤組織，ADAMTS－12參與了腰椎間盤組織的退變過程，其表達水平與腰椎間盤組織退變程度有一定關(guān)系。