劉志強(qiáng)，彭宇，鄒崢，柯江維

(江西省兒童醫(yī)院，江西 南昌 330006)

川崎?。↘awasaki disease，KD）又稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征 （mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），是一種以全身性血管炎為主要病理改變的疾病，最常見(jiàn)于5歲以下小兒，病理變化為全身性中小動(dòng)脈血管炎，其中冠狀動(dòng)脈最易受累，大量流行病學(xué)資料顯示川崎病已取代風(fēng)濕熱成為發(fā)達(dá)國(guó)家兒童后天性心臟病最主要的病因[1]。臨床上以持續(xù)發(fā)熱、口唇潮紅、球結(jié)膜充血、手足硬腫脫屑等皮膚、粘膜和淋巴結(jié)的炎性癥狀為主要表現(xiàn)。KD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者提出，可能是由于感染原激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生非特異性淋巴細(xì)胞或非特異性抗體，破壞受累動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，激發(fā)異常炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起一系列的病理改變和臨床表現(xiàn)[2]。本研究旨在探討γδT細(xì)胞及分泌的白細(xì)胞介素 （interleukin，IL）17在KD中的表達(dá)及其意義，為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 一般資料 選取2015年3月至2017年9月來(lái)我院風(fēng)濕免疫科治療的川崎病患兒123例作為病例組，其中男77例，女46例，平均年齡2．6歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合川崎病或不完全川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。另選同時(shí)期來(lái)我院門診體檢的健康兒童69例作為對(duì)照組，其中男40例，女29例，平均年齡2．8歲。兩組間兒童性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且征得家長(zhǎng)的同意并簽署知情同意書(shū)。

1．2 主要儀器和試劑 FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），TD5A－WS離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器離心機(jī)有限公司），MK－3酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），Iwo－960洗板機(jī)（安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），THERMO恒溫孵育箱 （美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。PE anti－h(huán)uman TCRγδ（美國(guó) BD 公司），Alexa Fluor 488 偶聯(lián) anti－h(huán)uman IL－17A McAb （美國(guó) BD 公司），PerCP anti－h(huán)uman CD3 McAb（美國(guó) BD 公司），Human IL－17A ELISA Kit、Human TGF－β1 ELISA Kit(杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司)。

1．3 研究方法

1．3．1 外周血 γδT17細(xì)胞的分析 研究對(duì)象入院時(shí)采集靜脈血2ml，肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，取1ml細(xì)胞懸液鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，且每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯(終濃度 50ng/ml)、莫能菌素(終濃度 10μg/ml)及離子霉素 (終濃度1μg/ml)吹打均勻，置于37℃、5%CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5h。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞于流式上樣管中，1000r/min離心5min，洗滌后PBS重懸。取30μl細(xì)胞懸液加入到另一流式上樣管中，分別加入PerCP anti－h(huán)uman CD3 McAb 和 PE anti－h(huán)uman TCRγδ 各 5μl進(jìn)行胞膜染色，室溫避光孵育20min；PBS洗滌后加入胞膜固定劑和破膜劑，再加入Alexa Fluor 488偶聯(lián) anti－h(huán)uman IL－17A McAb， 室 溫 避 光 孵 育20min，PBS洗滌后加入500μl PBS重懸細(xì)胞。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和同型對(duì)照組；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，所有數(shù)據(jù)采用FACSDiva軟件進(jìn)行分析。

1．3．2 血清 IL－17A、TGF－β1 測(cè)定 研究對(duì)象入院時(shí)用普通管采集靜脈血1ml，3000r/min離心3min，分離得到血清，置－80℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清IL－17A和TGF－β1表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒步驟要求進(jìn)行。

1．4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素t檢驗(yàn)，以P＜0．05表示差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組受試者外周血 γδT細(xì)胞含量的比較 γδT細(xì)胞在病例組外周血CD3+T細(xì)胞中的比例（11．24±2．31） 顯著高于正常對(duì)照組比例 （7．09±0．63）（P＜0．05）。 見(jiàn)表 1。

表1 兩組間γδT細(xì)胞含量的比較（±s）

表1 兩組間γδT細(xì)胞含量的比較（±s）

組別病例組對(duì)照組t值P值γδT%123 69 n 11．24±2．31 7．09±0．63 14．18＜0．05

2．2 兩組受試者血清IL－17A含量的比較 IL－17A在病例組血清中的含量（11．19±3．48ng/l）顯著高于對(duì)照組中的含量（4．41±1．09ng/l）（P＜0．05）。 見(jiàn)表 2。

表2 兩組間外周血IL-17A水平比較（±s）

表2 兩組間外周血IL-17A水平比較（±s）

組別病例組對(duì)照組t值P值IL－17A(ng/l)123 69 n 11．19±3．48 4．41±1．09 15．29＜0．05

2．3 病例組和對(duì)照組血清TGF－β1含量的比較TGF－β1 在病例組血清中的含量 （9．31±1．84ng/ml）顯著高于對(duì)照組中的含量 （6．93±1．37ng/ml）（P＜0．05）。見(jiàn)表 3。

表3 兩組間外周血TGF-β1水平比較（±s）

表3 兩組間外周血TGF-β1水平比較（±s）

組別病例組對(duì)照組t值P值TGF－β1(ng/ml)123 69 n 9．31±1．84 6．93±1．37 9．35＜0．05

2．4 兩組受試者外周血 γδT17細(xì)胞含量的比較γδT17細(xì)胞在病例組外周血CD3+T細(xì)胞中的比例（3．68±1．70）顯著高于對(duì)照組（1．25±0．53）（P＜0．05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組間γδT17細(xì)胞含量的比較（±s）

表4 兩組間γδT17細(xì)胞含量的比較（±s）

組別病例組對(duì)照組t值P值γδT17%123 69 n 3．68±1．70 1．25±0．53 11．51＜0．05

3 討論

目前對(duì)于川崎病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，流行病學(xué)研究顯示，KD發(fā)病過(guò)程中至少存在一種感染因素啟動(dòng)了異常的免疫反應(yīng)[4]。KD急性期會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的高度激活，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞因子的高度活化，啟動(dòng)細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮出現(xiàn)炎癥性損傷[5]。免疫系統(tǒng)的高度活化及免疫損傷性血管炎是KD的顯著特征。

T細(xì)胞是免疫細(xì)胞的主要組分，它具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等。根據(jù)T細(xì)胞受體(T cell receper，TCR)受體不同，T細(xì)胞主要分為αβT和γδT細(xì)胞。γδT細(xì)胞的排列方式不同于其它細(xì)胞，是由TCR-γ和TCR-δ組合而成[6]。γδT根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和功能不同又可分為不同的亞型。在免疫應(yīng)答的早期階段，γδT細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)DC成熟在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著橋梁作用，被視為“免疫系統(tǒng)的第一道防線成員”[7]。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的γδT細(xì)胞相對(duì)于健康人來(lái)說(shuō)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，提示γδT細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生[8]。妊娠糖尿病患者γδT細(xì)胞在外周血PBMC及CD3+T細(xì)胞中的比例增高，提示疾病發(fā)生影響和改變了T細(xì)胞亞群的分布[9]。γδT細(xì)胞還可作為APC活化T淋巴細(xì)胞，并且輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。我們的研究顯示，相比于健康對(duì)照兒童，KD患兒γδT細(xì)胞的比例顯著增加?；仡櫥純翰∈?，患兒多在發(fā)熱持續(xù)3至5d左右就診，此時(shí)患兒尚處于疾病早期。γδT細(xì)胞是一類重要的固有免疫細(xì)胞，它們能快速地 （數(shù)小時(shí)內(nèi)）啟動(dòng)宿主體內(nèi)的免疫應(yīng)答，并且只需少量細(xì)胞就能發(fā)揮重要作用。因此，我們認(rèn)為γδT細(xì)胞在KD患兒發(fā)病早期發(fā)生了高度活化，γδT細(xì)胞參與了KD早期的炎癥過(guò)程。

IL-17A是一種促炎因子，主要由T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)合成，是T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，它能夠募集中性粒細(xì)胞，促使T淋巴細(xì)胞活化，還可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成與分泌IL-6、IL-8等刺激因子，加重局部炎癥反應(yīng)[10]。王振杰[11]等研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少癥患者血清IL-17、IL-12表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組；提示介導(dǎo)自身免疫的IL-17等炎性因子的表達(dá)水平與風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少癥患者的造血細(xì)胞炎性受損相關(guān)病變程度密切相關(guān)。在關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎的研究中亦發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康對(duì)照兒童，病例組患兒血清IL-17明顯升高，且與疾病活動(dòng)密切相關(guān)[12，13]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growthfactor-β，TGF-β）是一種以抑制免疫為主的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，TGF-β1是TGF-β在體細(xì)胞系中含量最高、活性最強(qiáng)的一種亞型，可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞的功能和促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫抑制作用，穩(wěn)定機(jī)體免疫平衡[14]。然而Peters[15]等研究證實(shí)肺纖維化時(shí)IL-17通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β和膠原蛋白產(chǎn)生直接促進(jìn)肺纖維化。我們研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照兒童相比，KD患兒血清IL-17A和TGF-β1的含量顯著增高，高水平的IL-17A和TGF-β1與KD的發(fā)病密切相關(guān)。推測(cè)IL-17A作為促炎因子參與了KD發(fā)生，對(duì)其濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以為KD的炎癥干預(yù)提供有效指導(dǎo)。血清TGF-β1水平升高可能是IL-17A誘導(dǎo)所致，即IL-17A作為促炎因子參與了KD的炎癥反應(yīng)的同時(shí)，可能又誘導(dǎo)了抑炎因子TGF-β1的產(chǎn)生，其機(jī)制和功能還有待進(jìn)一步證實(shí)。

γδT細(xì)胞具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中最主要的是溶解靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和分泌不同種類的細(xì)胞因子和趨化因子。IL-17A作為一種重要的炎癥介質(zhì)，早期的研究認(rèn)為其主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，但近些年的研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞和多種固有免疫細(xì)胞如γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等也能夠產(chǎn)生IL-17A[16]。γδT細(xì)胞作為產(chǎn)生IL-17的重要T細(xì)胞，與Th17細(xì)胞有一些共同的特征，不同之處在于γδT細(xì)胞可通過(guò)Toll樣受體直接與某一病原體相互作用[17]。在某些情況下，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的能力比Th17細(xì)胞更強(qiáng)。在一些自身免疫性疾病的小鼠模型中，給予完全弗式佐劑后，γδT細(xì)胞是最早且大量產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞。有報(bào)道，由γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17在對(duì)肺分枝桿菌卡介苗感染和卡介苗誘導(dǎo)的肺肉芽腫的免疫反應(yīng)中起著重要作用。薛春雪[18]等研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞可能以γδTCR非依賴的方式活化，并且通過(guò)釋放IL-17A參與H1N1重癥感染小鼠早期肺組織的炎性損傷過(guò)程。我們研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康對(duì)照組，γδT17細(xì)胞比例在病例組中明顯升高。所以，我們認(rèn)為對(duì)于KD的發(fā)病，γδT細(xì)胞和血清IL-17A都扮演著重要角色，且此時(shí)血清中的IL-17A濃度的升高很大程度上是由于產(chǎn)生IL-17A的γδT細(xì)胞增多所致，這與Corpuz等[19]的研究進(jìn)一步證實(shí)γδT細(xì)胞是IL-17的重要來(lái)源這一結(jié)果基本一致。至于此時(shí)是否還伴有分泌IL-17A的其它細(xì)胞如：Th17細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)量上的改變還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

γδT細(xì)胞是一類特殊的T細(xì)胞，細(xì)胞亞群眾多，生物學(xué)效應(yīng)多樣。目前在小鼠模型的研究中證實(shí)產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞與多種感染及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。γδT17細(xì)胞的生物學(xué)特性、在疾病中的作用及作用機(jī)制還了解很少，相信隨著對(duì)γδT17細(xì)胞的研究日益深入，γδT17細(xì)胞的應(yīng)用也將會(huì)有更廣闊的前景。