肖越勝 ，張軍 ，唐陽 ，楊立坤 ，張晉

(1、揚州市醫(yī)學檢驗中心，江蘇 揚州 225001；2、揚州市疾病預防控制中心，江蘇 揚州 225001)

人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬嗜肝DNA病毒科，基因組是不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長度約3．2kb，有四個部分重疊的開放式閱讀框（ORF），前 S/S 區(qū)（PreS/S）、PreC/C、Pol、X。 其中PreS/S區(qū)編碼大、中、小3種包膜蛋白。HBV序列異質性是一個特征，源于其較高的病毒復制產(chǎn)量及突變率，該突變是由于在逆轉錄過程中缺乏校對的酶而造成的。長期的自發(fā)性突變使基因序列產(chǎn)生差異，依據(jù)HBV DNA全序列的核苷酸差異，共分 A－I九個基因型[1，2]。HBV 基因型中存在混合感染的現(xiàn)象和明顯的地域分布，我國HBV感染以 B和 C型為主，占 90%以上[3，4]，南方以 B和 C型為主，A型和D型在我國東部地區(qū)有少量存在。HBV在復制過程中催化逆轉錄過程的酶缺乏3’－5’核酸外切酶活性，從而缺乏校正功能，不能修正在外界選擇壓力改變下C、S區(qū)等產(chǎn)生的變異，使其抗原性減弱，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象。目前有關HBV S區(qū)基因變異與乙肝疫苗免疫失敗、肝移植乙肝免疫球蛋白逃逸、隱匿性HBV感染等方面的研究較多[5，6]。揚州市HBV感染以基因B、C型為主[7]，但在感染過程中病毒的前S基因變異和特征目前未有報道。

1 材料與方法

1．1 樣本來源 樣本采自本中心門診，靜脈采血，3000rpm離心，取血清進行乙型肝炎病毒核酸(HBV－DNA)熒光PCR檢測，留取核酸陽性樣本－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 試劑和儀器 HBV DNA熒光定量PCR，艾肯生物技術有限公司（杭州）；Viral Nucleic Acid Iso鄄lation Kit，江蘇碩世生物科技有限公司；PreS引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR試劑，寶生物工程（大連）有限公司；普通PCR儀和電泳儀，美國BIO－RAD公司。

1．3 研究方法

1．3．1 血清熒光PCR檢測，取具有典型熒光擴增曲線的標本，按文獻[7]進行基因分型，取基因B型病毒 7株 YZ01－YZ07，其中 YZ01－YZ04病毒載量大 于 105copies/ml，YZ05－YZ07 病 毒 載 量 小 于105copies/ml。

1．3．2 PreS PCR 引物， 采用 DNAStar PrimerSelect設計HBV PreS基因區(qū)間通用引物，上游引物YZS－A：5′－cgaaaaggcatggggacaaatc(nt2872－2983)；下游引物 YZS－B：5′－ggagccaccagcaggaaagta(nt49－70)， 產(chǎn)物 414bp。 擴增條件：94℃ 1min；98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 30s，35 個循環(huán)。

1．3．3 PreS 基因擴增片段，1．5%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物送南京金斯瑞公司進行測序。

1．3．4 基因分析 參考序列為從GenBank下載的HBV A－H基因型的序列，分別為A基因型：X51970；B 型 ：033554，AB073858，AF121244，AF100309，D00329；C 型 ：AB014381，AB033556，AF068756，X04615；D 型 ：M32138，X65259；E 型 ：AB032431，X75657；F 型 ：AB036910，X69798；G型 ：AB064310，AF160501；H 型 ：AY090454，AY090457。20條參考序列與研究樣本序列用BioEdit軟件對齊，DNAStar MegAlign軟件Clustal W比對構建距離矩陣，采用neighbor－joining法構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1．3．5 將研究樣本序列和基因 B型參考序列(nt2926－70)用EditSeq翻譯成氨基酸序列后，輸入MegAlign比對。翻譯的氨基酸序列共120AA，對應表位是 PreS：AA27－146。

2 結果

2．1 PreS片段PCR結果 將已分型的7株病毒核酸進行PreS基因片段擴增，產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴增結果與設計擴增片段大小相符，證明PCR擴增模板為HBV DNA（見圖1）

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2．2 同源性分析 擴增產(chǎn)物測序成功6條。將所測PreS基因片段序列和20條參考序列經(jīng)軟件比對，得出基因比對矩陣。揚州市6例樣本間同源性分別為 97．2%～98．6%，其中 YZ07 與 YZ02、03 同源最高為 98．6%，與 YZ06 最低為 97．2%，與同基因型參考株的同源性為：92．8%～100%。參考序列033554與研究樣本間同源性為：92．8%～94．8%，與 YZ06 的同源性最低為92．8%，低于其他基因B型參考序列。參考序列AF121244與研究樣本間同源性高于其他基因B參考序列，與YZ03的同源性最高為100%，。研究樣本與其他基因型參考株間的同源性為：78．1%～86．2%，與基因 H 型的同源性最低。

2．3 遺傳進化分析 將測序結果和參考序列共26條序列對齊后構建系統(tǒng)發(fā)生樹，結果顯示26條序列分成8個分支，分別對應A～H 8個基因型 （圖2）。揚州6株序列與B型參考序列在一個大分支上，證明所選樣本均為HBV基因B型。其中YZ01、02、06、07 與 AF121244、AF100309 在同一小分支上，遺傳距離較近，YZ03、04各在單一的小分支上，與其他序列無共用分支。另3株B型參考株在其他分支上，與研究樣本的遺傳距離較遠。

2．4 PreS基因突變位點 揚州6株序列和在同一小分支上同源性最高的基因B型參考序列AF121244按1．3．5方法比對后發(fā)現(xiàn)存在缺失和突變現(xiàn)象。YZ07發(fā)現(xiàn)有4個突變位點，YZ06有3個突變位點，YZ01有1個突變位點，6例研究樣本中3例發(fā)生突變，分別為PreS：AA39．YZ06缺失谷氨酸，AA44．YZ07天冬氨酸由天冬酰胺替代(D→N突變)，AA45．YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代 （L→F突變），AA78．YZ07絲氨酸由天冬酰胺替代 （S→N突變），AA108.YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代（L→F突變），AA109.YZ01和YZ06絲氨酸由蘇氨酸替代（S→T突變），AA114.YZ06天冬氨酸由纈氨酸替代（D→V 突變）。 YZ02、03、04與參考序列比對未發(fā)現(xiàn)突變。

圖2 揚州市6株病毒與20條參考序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

人乙型肝炎病毒的流行在揚州以基因B和C型為主，本研究發(fā)現(xiàn)，揚州市HBV B基因型間同源性高，所研究樣本之間的同源性高于與參考株間的同源性，且在遺傳進化樹中，與AF121244和AF100309的在同一小分支上，表現(xiàn)為較強的親緣關系，說明揚州HBV間遺傳距離近，流行地域特征明顯。

S 區(qū)分為 PreS（preS1、preS2)和 S 基因，分別編碼表面蛋白的大蛋白、中蛋白和主蛋白，其中大蛋白對HBV的感染吸附起關鍵作用。PreS基因包含許多B或T細胞表位并發(fā)揮多種功能[8]。因此PreS基因的突變會引起病毒外殼蛋白組成的改變，影響到B或T細胞的識別，影響到免疫系統(tǒng)對病毒的識別，是傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)生免疫失敗主要原因[9]。人類白細胞抗原 (HLA)-I類分子結合來自胞內(nèi)加工的肽段，因此這些分子提供消除胞內(nèi)病毒并在胞內(nèi)浸潤的CD8+T細胞[10]。到目前為止人們已在8種HBV基因型中發(fā)現(xiàn)60種HBV特異性的HLAI限制性表位和32種HBV特異性的HLA-Ⅱ限制性表位[11]。許智慧[12]發(fā)現(xiàn)乙肝患者HBV PreS/S的表位變異降低了病毒對CTL(細胞毒性T細胞)結合的親和力，S區(qū)中S基因為保守區(qū)域，其變異率較低，而PreS1基因的變異率高于S基因。本研究的6株樣本發(fā)現(xiàn)PreS基因有7個位點發(fā)生突變，存在較高的突變率。PreS基因突變率隨著肝病的進程呈現(xiàn)明顯遞增的趨勢，基因突變促進了肝病的進展[13]。因HBV不同位點的缺失和突變的意義不同，對肝病的進程和病毒免疫都有重要影響，研究不同位點的突變對臨床和被動免疫有重要作用。揚州6株PreS區(qū)氨基酸的突變?yōu)辄c突變，且氨基酸替代未改變極性，所以蛋白質抗原性未發(fā)生改變。低病毒載量YZ06、YZ07發(fā)現(xiàn)7個突變點，而高病毒載量病毒株僅YZ01存在1個，低于王社梁等[14，15]的研究，這或許與肝炎病毒是否處于活動期、病情所處階段以及是否長期服藥等有一定的關系。突變積累以及氨基酸替換的點位是否會影響本地的被動免疫，有待進一步觀察。由于本次研究樣本數(shù)較少，影響突變位點和氨基酸替換率統(tǒng)計，未發(fā)現(xiàn)突變優(yōu)勢株，不能明確基因型與臨床表型之間的關系。研究發(fā)現(xiàn)的突變是否對臨床有意義，有待以后研究。