徐疏梅

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

1953年，Watson 和Crick 發(fā)現(xiàn)DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)[1]，之后人們認(rèn)識到生物的遺傳信息是由DNA 序列決定的， 即A、T、C、G 這4種堿基的排列方式?jīng)Q定了生物的形態(tài)、生長發(fā)育以及疾病等特征.那么,如何破解“生命密碼”，探究物種的DNA 序列及其完整性，則成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門話題.隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，DNA 測序技術(shù)(又稱基因測試技術(shù))在業(yè)界人士的關(guān)注、研究與促進(jìn)下，有了迅猛的發(fā)展，不僅在傳統(tǒng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域開辟了新的視角，并推動(dòng)生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，而這些學(xué)科的發(fā)展又促進(jìn)生命科學(xué)研究的進(jìn)步.1977年，被奉為標(biāo)志性測序技術(shù)的Sanger鏈終止測序法誕生，自此第一代DNA測序方法正式浮出水面，并因其高準(zhǔn)確性一直沿用至今.21世紀(jì)以來，第二代高通量測序技術(shù)取得了快速發(fā)展及廣泛的應(yīng)用，而第三代單分子測序技術(shù)逐漸走向成熟和多元化，受到廣大科研人員的關(guān)注與歡迎.這些測序技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，加快了對人類信息探索的發(fā)展，如2008年1月，“國際千人基因組計(jì)劃”啟動(dòng)，它由中國深圳華大基因研究院、美國國立人類基因組研究所、英國桑格研究所承擔(dān)，繪制了有史以來最有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值、最為詳盡的人類基因組遺傳多態(tài)性圖譜；2012年11月，該計(jì)劃研究人員首次對比分析了千人規(guī)模以上的基因組，發(fā)布了1 000余人的基因數(shù)據(jù)，在生命科學(xué)研究中取得了劃時(shí)代的進(jìn)展[2].DNA測序技術(shù)的發(fā)展路徑如圖1[3]所示.本文闡釋了DNA測序技術(shù)的應(yīng)用與研究進(jìn)展，旨在為生命科學(xué)研究人員提供研究依據(jù)與方向.

圖1 DNA測序技術(shù)發(fā)展歷程

1 第一代DNA測序技術(shù)

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)之后，在1954年，Whitfeld等[4]利用磷酸單酯酶的脫磷酸作用、高碘酸鹽的氧化作用，將含脫氧核糖的寡核昔酸從鏈末端逐一分離，并測定其種類，即為測量多聚核糖核苷酸的化學(xué)降解法.然而，這種方法的操作極其復(fù)雜，無法被廣泛應(yīng)用，直到1977年，英國生物化學(xué)家Sanger等提出的雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及Maxam等提出的類似的化學(xué)降解法，標(biāo)志著DNA測序技術(shù)的正式誕生.

1.1 桑格-庫森法(Sanger-Coulson method)

1977年，Sanger等[5]提出了雙脫氧核苷酸末端終止測序法，發(fā)明了第一代測序技術(shù).我國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì)審定公布的《遺傳學(xué)名詞》( 2007 年)、《生物化學(xué)與分子生物學(xué)名詞》(2008 年)、《細(xì)胞生物學(xué)名詞》(2009 年)中，均將其命名為桑格-庫森法(Sanger-Coulson method)，我國很多網(wǎng)站和學(xué)術(shù)論文將其簡稱為Sanger測序法.桑格-庫森法的定義為以2，3-雙脫氧核苷三磷酸為底物，快速測定DNA 中核苷酸序列的方法[6].該方法的核心原理是因?yàn)殡p脫氧核苷酸(ddNTP)的2′和3′上都不含羥基，使得DNA的合成過程中無法形成磷酸二酯鍵，因而將其用以中斷DNA合成反應(yīng).具體而言就是在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中，在DNA 模板鏈上分別加入一定比例的互補(bǔ)參入?yún)s不能延伸的4種雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP)，而它們都帶有放射性同位素標(biāo)記，然后與正常的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)競爭，再通過凝膠電泳和放射自顯影的方法，根據(jù)4條泳道上的條帶順序來確定待測分子的DNA序列.

1.2 化學(xué)降解法(Maxam-Gilbert method)

1977年，Maxam等[7]發(fā)明了DNA片段序列的測定方法，即化學(xué)降解法.化學(xué)降解法與桑格-庫森法類似，其核心原理是首先將1個(gè)DNA片段的5′端磷酸基作32P 放射性標(biāo)記，然后利用特殊試劑降解，即采用不同的化學(xué)方法，修飾、裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一且5′端被標(biāo)記的DNA片段，再將這些以特定堿基結(jié)尾的片段群，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行片段分離，并采用放射性自顯影技術(shù)，判斷各片段末端堿基，讀出目的DNA序列[8-9].

1.3 第一代測序技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展

迄今為止，人類獲得的絕大部分DNA序列都是基于桑格-庫森法獲得的[10]，它與化學(xué)降解法的應(yīng)用，帶來了DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展：1986年，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Inc，ABI)推出的第一代商用ABI 370A 測序儀可在雙脫氧核苷酸上直接標(biāo)記不同顏色熒光基團(tuán)；1998年，ABI采用其開發(fā)的毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，推出的ABI Prism 3700毛細(xì)管測序儀可同時(shí)進(jìn)行96 個(gè)并行測序反應(yīng)，真正實(shí)現(xiàn)了測序規(guī)模化[11-12]；ABI Prism 3730是ABI Prism 3700基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，至今仍是第一代測序的主力機(jī)型，也常用于驗(yàn)證其他新測序設(shè)備的準(zhǔn)確性.在這一時(shí)期，還出現(xiàn)了諸如焦磷酸測序法、鏈接酶法等其他測序技術(shù).

毛細(xì)管電泳測序方法的出現(xiàn)與應(yīng)用，促進(jìn)了人類基因組計(jì)劃的完成.1985年，美國科學(xué)家提出人類基因組計(jì)劃，于1990年正式啟動(dòng)，測定了人類染色體的30億個(gè)堿基對組成的核苷酸序列，繪制了人類基因組圖譜，并且識別其載有的基因及其序列信息，達(dá)到破譯人類基因遺傳密碼的最終目的[13].截止到2005年，人體全序列的基因測定工作已經(jīng)完成[14-15].整個(gè)計(jì)劃歷時(shí)15 a，其中中國、美國、英國、法國、德國和日本6個(gè)國家的科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃，而人類基因序列圖則己成為全人類共同的財(cái)富[16].該項(xiàng)目的完成標(biāo)志著分子醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來，也開啟了人類基因組測序的新時(shí)代.

2 第二代DNA測序技術(shù)

盡管第一代DNA測序技術(shù)以其可達(dá)1 000 bp的測序讀長、99.999%的高準(zhǔn)確性幫助人們完成了大量的測序工作，但其測試速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大眾化的應(yīng)用.隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及科研人員對測序技術(shù)的努力開發(fā)，2005年Roche公司發(fā)布的454測序系統(tǒng)標(biāo)志著測序技術(shù)跨入高通量并行測序的時(shí)代.第二代DNA測序技術(shù)又稱次世代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)、大量并行測序技術(shù)(massive parallel sequencing，MPS)、高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing，HTS)，以低成本、99%以上的準(zhǔn)確度，1次可對幾百、幾千個(gè)樣本的幾十萬至幾百萬條DNA分子同時(shí)進(jìn)行快速測序分析.這一時(shí)期的代表技術(shù)有Roche公司的454、Illumina公司的Solexa、ABI公司的SOLID，由于該時(shí)期的測序技術(shù)十分前沿，因而市場主要被這3家公司所壟斷.

2.1 Roche 454測序技術(shù)

2005年，美國的羅氏(Roche)公司利用焦磷酸測序法研發(fā)出不同于第一代的測序技術(shù)，即454測序技術(shù).這項(xiàng)技術(shù)的核心原理是依靠生物發(fā)光技術(shù)對DNA 序列進(jìn)行分析，在DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上的dNTP 聚合與1次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號的強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA 序列的目的.其測序步驟是利用噴霧法把待測的DNA樣本主要打斷成300～800 bp長的序列片段后構(gòu)建測序文庫、微乳液PCR的擴(kuò)增及測序分析[17].454測序系統(tǒng)是第一個(gè)被商業(yè)化的平臺，但隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，羅氏公司已宣布454焦磷酸測序儀退出市場.

2.2 Illumina Solexa 測序技術(shù)

2006年， Solexa 公司發(fā)明了Solexa 測序技術(shù)，后被美國的Illumina公司收購.Solexa測序技術(shù)基于高密度的單分子陣列進(jìn)行序列測定，其步驟是：1)首先用超聲或氮?dú)獾确椒▽NA 隨機(jī)打斷成100～200 bp 片段，再在兩端加上通用接頭，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建ssDNA文庫；2)將接好接頭的待測DNA片段放入含有基片的流通池內(nèi)，片段的另一端因隨機(jī)與附近的另一接頭序列互補(bǔ)而被固定，使得打斷的DNA 片段兩端固定在基片上，形成橋狀結(jié)構(gòu)，即橋式擴(kuò)增；3)在8個(gè)微流道的測序芯片上進(jìn)行測序，可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)[18-19].

2.3 ABI SOLID測序技術(shù)

2007年，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司基于連接酶法開發(fā)了SOLID測序技術(shù)，并將其用于商業(yè)測序.SOLID測序技術(shù)以連接酶的連接反應(yīng)取代聚合酶的聚合反應(yīng)，并采用雙堿基編碼的方式獲取DNA序列信息.其測序步驟是：1)將基因組DNA 打斷成100～200 bp 片段，在片段兩端加上測序接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫；2)微乳液PCR的擴(kuò)增，其過程與454測序方法類似，只是測試模板微球更小，僅1 μm；3)加入連接酶進(jìn)行連接測序[20-21].

2.4 三種測序技術(shù)的比較

以上三種測序技術(shù)的特征、成本及特點(diǎn)見表1.

表1 第二代DNA典型測序技術(shù)的特征、成本及特點(diǎn)

2.5 第二代測序技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展

繼三種典型測序技術(shù)之后，有了新的發(fā)展，先后出現(xiàn)了Ion Torrent、Heliscope、Nanopore、SMRT、Ion PGM、GeXp等第二代、第三代測序技術(shù).這些技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用極大地加速了基因組重測序、宏基因組測序、DNA甲基化測序、轉(zhuǎn)錄組測序、目標(biāo)基因組區(qū)域再測序、基因的表觀遺傳修飾檢測、微生物檢測等領(lǐng)域的研究工作，解決了第一代測序技術(shù)無法大規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)的現(xiàn)實(shí)問題.

3 第三代DNA測序技術(shù)

近年來，為了更加精確與高效地挖掘DNA序列信息，科研人員研究、開發(fā)出第三代測序技術(shù)，即單分子測序( single molecule sequencing)技術(shù).這項(xiàng)技術(shù)與前兩代技術(shù)不同的是測序時(shí)不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而是基于單分子水平的邊合成邊測序思想，實(shí)現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序.目前其測序技術(shù)原理主要分為兩大類：1)單分子熒光測序[22]，以Helisope Bioscience公司的SMS 技術(shù)、Pacfic Bioscience 公司的SMRT 技術(shù)為代表，用熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行探測，用顯微鏡觀測、記錄熒光強(qiáng)度的實(shí)時(shí)變化；2)納米孔測序[23]，以英國牛津納米孔公司為代表，利用直徑非常細(xì)小的納米孔，根據(jù)不同堿基產(chǎn)生的電信號的差異進(jìn)行測序.

第三代DNA測序技術(shù)相較于前兩代測序技術(shù)，具有超長讀長、運(yùn)行快、無需模板擴(kuò)增、直接檢測表觀修飾位點(diǎn)等特點(diǎn)，主要用于基因組測序、甲基化研究、突變鑒定(SNP檢測)等方面. 第三代測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是巨大而不可比擬的，但該代技術(shù)尚處于發(fā)展階段，還未成熟和多元化，測序精度還低于前兩代技術(shù)，用于商業(yè)化的測序儀相對較少.

4 結(jié)語

第一代DNA測序技術(shù)的產(chǎn)生宣示了劃時(shí)代的生命科學(xué)研究的到來，其高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)使其至今仍然被應(yīng)用；第二代DNA測序技術(shù)具有速度快、成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，其發(fā)展給生命科學(xué)領(lǐng)域的研究帶來了空前的進(jìn)步，但也存在所測DNA長度較短的問題，需要第一代測序技術(shù)的佐證；第三代技術(shù)大幅降低了測序費(fèi)用，是未來的發(fā)展方向.從三代DNA測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用可知，DNA測序技術(shù)的產(chǎn)生與快速發(fā)展為生命科學(xué)研究帶來了革命性的改變，可以一次性對某個(gè)物種的DNA到RNA的遺傳信息進(jìn)行全貌解析，使得人類知曉并掌握自身的全基因組序列，以及水稻、小麥、家蠶等其他物種的基因序列，甚至包括細(xì)菌的基因序列.同時(shí)，SNP的大量存在，也使人們認(rèn)識到人類基因組圖譜并不是獨(dú)一無二的，每個(gè)人的獨(dú)特圖譜是實(shí)際存在的.因而，如何快速、經(jīng)濟(jì)、高通量、高精確性地探明一段DNA序列所代表的生物學(xué)意義，使人類對自然和自身的認(rèn)知進(jìn)入到新的科學(xué)層面，則成為科研人員的孜孜不倦的追求目標(biāo).