李文艷，李晨軍，羊書(shū)勇，何勇

（1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院附屬口腔醫(yī)院，四川 成都 610021）

隨著人們對(duì)正畸治療過(guò)程中的美觀要求越來(lái)越高，氧化鋯陶瓷托槽再次成為研究的熱點(diǎn)。但是，氧化鋯陶瓷托槽尚未在臨床廣泛使用，關(guān)于它對(duì)細(xì)菌附著能力的影響尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。由于變形鏈球菌是牙齒的主要致齲菌。因此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，對(duì)比氧化鋯陶瓷托槽和氧化鋁陶瓷托槽表面附著的變形鏈球菌構(gòu)成比例，評(píng)價(jià)氧化鋯陶瓷托槽對(duì)變形鏈球菌附著能力的影響，以供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

氧化鋯陶瓷托槽（上海晶璀新材料科技有限責(zé)任公司）、氧化鋁單晶陶瓷托槽（美國(guó)3M公司）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，Cat#D1600，北京索萊寶科技有限公司）、微生物培養(yǎng)箱（Precision，美國(guó)熱電公司）、普通PCR儀（CFX96，美國(guó)百樂(lè)公司）、熒光定量PCR儀（CFX96，美國(guó)百樂(lè)公司）、AceQ qPCR Probe Master MIX（500rxn，南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.2 托槽表面的細(xì)菌培養(yǎng)

1.2.1 唾液的收集 MCBAIN[1]研究認(rèn)為，唾液是體外培養(yǎng)菌斑生物膜的理想來(lái)源。因此筆者采集30名健康正畸青少年的唾液15 ml，將采集的唾液與腦心浸出液肉湯（brain heart infusion, BHI）培養(yǎng)基配置成1%的菌懸液作為生物膜培養(yǎng)基。唾液采集方法為：囑患者用清水漱口后，將舌尖抬高靠于硬腭處，頭微低，使唾液在口底匯集，緩慢流入放在下嘴唇處的無(wú)菌EP管內(nèi)，用干冰低溫運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室中，-20℃保存，保存時(shí)間＜1周。

1.2.2 托槽生物膜的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分為氧化鋯陶瓷托槽和氧化鋁陶瓷托槽，各9枚。在24孔板的每個(gè)孔放入2 ml菌懸液和1個(gè)托槽。每個(gè)24孔板中任取1個(gè)孔設(shè)置為陰性對(duì)照組，為不含托槽和唾液的BHI液體培養(yǎng)基。將以上培養(yǎng)物放入37℃的微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于8、16及24 h后換1次培養(yǎng)基。具體方法為：用鑷子取出托槽，取1 ml無(wú)菌BHI培養(yǎng)液漂洗托槽，沖去托槽表面的游離細(xì)菌，每個(gè)托槽漂洗3次，然后將托槽放入新配制的菌懸液中。以上操作連續(xù)傳代培養(yǎng)72 h，完成托槽表面的細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

1.3.1 提取細(xì)菌基因組DNA 將培養(yǎng)后的托槽取出，并用BHI液體培養(yǎng)基漂洗3次后置于干凈的EP管內(nèi)，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計(jì)并合成引物 由四川擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成引物，變異鏈球菌引物序列如下，正向引物：CCGGTGACGGCAAGCTAA，反向引物：TCATGGAGGCGAGTTGCA， 探 針：5′FAMCTCTGAAAGCCGATCTCAGTTCGGATTG-TAMRA-3，產(chǎn)物大小70 bp[2]；通用菌引物序列如下，正向引物：GCTAGTAATCGTGGATCAGAATG， 反 向 引物：TGTGACGGGCGGTGTGTA， 探 針：5′FAMCACGGTGAATACGTTCCCGGGC-TAMRA-3′，產(chǎn)物大小69 bp[3]。其中，通用菌引物用于計(jì)數(shù)樣本中的細(xì)菌總數(shù)。

1.3.3 制備標(biāo)準(zhǔn)品 通過(guò)化學(xué)合成方法合成變異鏈球菌和大腸埃希菌的16S rRNA目的基因片段并分別裝載目的基因至pUC19載體，酶切位點(diǎn)為SmaI。變形鏈球菌的目的基因選自NCTC 10449細(xì)菌（GenBank：AJ243965.1），通用菌的目的基因選自NBRC 102203（Sequence ID：NR_114042.1），成功裝載至pUC19載體的目的基因經(jīng)測(cè)序與GenBank中相應(yīng)細(xì)菌基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示插入相應(yīng)載體序列與基因庫(kù)相應(yīng)序列信息完全一致，表明載體構(gòu)建正確。將正確構(gòu)建的載體搖擴(kuò)大培養(yǎng)，大提質(zhì)粒并定量保存至-20℃冰箱備用。質(zhì)粒濃度通過(guò)微量比色儀得知。

1.3.4 熒光定量PCR反應(yīng) 先行普通PCR反應(yīng)，然后5%的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)引物和探針的特異性良好（見(jiàn)圖1）。將變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋成5個(gè)濃度，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)使用AceQ qPCR Probe Master MIX（500rxn，南京諾唯贊生物科技有限公司）。所有的樣本檢測(cè)均重復(fù)3次，取平均值。反應(yīng)在CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96，美國(guó)Bio-Rad公司）上進(jìn)行，使用Bio-Rad CFX Manager軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。反應(yīng)條件設(shè)置如下：50.0℃預(yù)變性10 min，95.0℃變性10 min，循環(huán)反應(yīng)40次后95.0℃變性10 s，55.0℃退火30 s，信號(hào)采集。最后形成以Ct值為縱坐標(biāo)，起始模板量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩種托槽的細(xì)菌濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得知（見(jiàn)圖2）。然后按照公式：細(xì)菌數(shù)量（copies）=濃度（ng/μl）×10～9/（序列長(zhǎng)度×649），換算成細(xì)菌拷貝數(shù)。變異鏈球菌的構(gòu)成比=變異鏈球菌（copies）/總細(xì)菌（copies）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性

隨機(jī)選取氧化鋯陶瓷托槽和氧化鋁陶瓷托槽的DNA樣本各2個(gè)，并選取變形鏈球菌和通用菌的重組質(zhì)粒各4個(gè)，經(jīng)普通PCR反應(yīng)后，用瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)鑒定，結(jié)果示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均＜100 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明引物特異性良好，重組質(zhì)粒合成正確。見(jiàn)圖1。

2.2 變形鏈球菌和通用菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Nano-drop紫外分光光度計(jì)檢測(cè)變形鏈球菌質(zhì)粒濃度為120 ng/μl，通用菌為197.1 ng/μl，標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)5個(gè)梯度稀釋后，熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得1條以起始模板拷貝數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，以CT值（Y）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.964和0.996，擴(kuò)增效率＞80%。見(jiàn)圖2。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳成像圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 兩種托槽表面的附著細(xì)菌比較

氧化鋯陶瓷托槽表面的變形鏈球菌構(gòu)成比 為（73.03±39.74）%， 氧 化 鋁 陶 瓷 托 槽 為（51.76±34.52）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.212，P=0.243），氧化鋯陶瓷托槽表面的變形鏈球菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)分別為（4.31±2.44）×109和（7.26±3.35）×109個(gè)，氧化鋁陶瓷托槽分別為（2.62±4.76）×109和（7.32±4.07）×109個(gè)，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.045和0.037，P=0.073和 0.971）。

3 討論

隨著生活水平的提高，人們對(duì)牙齒矯正過(guò)程中的美觀性提出了更高的要求。目前正畸臨床工作中最常使用的美觀托槽主要是氧化鋁陶瓷托槽，但有文獻(xiàn)表明，氧化鋁陶瓷托槽具有機(jī)械性能差、易折裂、椅旁操作時(shí)間長(zhǎng)及易脫落等缺點(diǎn)[4]。而氧化鋯陶瓷的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、美觀及生物相容性好，抗彎強(qiáng)度為900～1 200 MPa，斷裂韌性為9～10 MPa·m1/2，是氧化鋁陶瓷的2～3倍[5]。氧化鋯陶瓷托槽早在1994年就被研發(fā)出來(lái)，但是由于加工工藝等科學(xué)技術(shù)限制，沒(méi)有在臨床中被推廣使用，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，它再次成為正畸研究的熱點(diǎn)[5]。粘接強(qiáng)度和對(duì)細(xì)菌附著能力的影響，是評(píng)價(jià)正畸托槽良好性質(zhì)的基本條件，在對(duì)細(xì)菌附著能力影響的方面，尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將兩種美觀托槽做對(duì)比，研究氧化鋯陶瓷托槽是否更利于保持牙面衛(wèi)生。

在粘接強(qiáng)度方面，筆者前期采用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)氧化鋯陶瓷托槽、氧化鋁陶瓷托槽和金屬托槽在離體前磨牙上的抗剪切粘接強(qiáng)度，結(jié)果顯示，兩種陶瓷托槽組與牙面的抗剪切粘接強(qiáng)度無(wú)明顯差異，但兩者較金屬托槽組的粘接強(qiáng)度高，它們的粘接強(qiáng)度均在臨床適用范圍之內(nèi)。另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有3枚氧化鋁陶瓷托槽發(fā)生折裂，而氧化鋯陶瓷托槽無(wú)折裂情況發(fā)生，可見(jiàn)氧化鋯陶瓷托槽的抗折強(qiáng)度可能較氧化鋁陶瓷托槽高，利于臨床使用。

應(yīng)用TaqMan探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，只有能夠與探針堿基互補(bǔ)且發(fā)生雜交反應(yīng)的PCR擴(kuò)增才能正常產(chǎn)生熒光信號(hào)，較實(shí)時(shí)熒光定量PCR更加準(zhǔn)確。石晶等[6]應(yīng)用此方法檢測(cè)了正畸病人口腔變異鏈球菌的變化。BAKA等[7]應(yīng)用此方法檢測(cè)牙冠表面包括變形鏈球菌在內(nèi)的4種細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)采用此方法檢測(cè)氧化鋯陶瓷托槽對(duì)變形鏈球菌的影響。

變形鏈球菌是口內(nèi)牙齒白斑形成的主要致病菌，可達(dá)其他細(xì)菌數(shù)量的2倍[7]。固定矯治器可影響口腔變形鏈球菌的數(shù)目[8]。有研究表明，自鎖托槽與普通金屬托槽和普通金屬托槽與塑料托槽比較，它們對(duì)變形鏈球菌的附著性均無(wú)差異[7，9]。在評(píng)估牙面白斑的形成方面由于研究變形鏈球菌在總菌中所占比例比單獨(dú)研究變形鏈球菌更有意義，所以實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了變形鏈球菌在總菌中的構(gòu)成比[10]。結(jié)果顯示，兩種陶瓷托槽對(duì)變形鏈球菌的附著性比較無(wú)差異，這可能就是因?yàn)樗鼈兙鶠槎栊圆牧?，其理化性質(zhì)均穩(wěn)定[11]?？梢?jiàn)，兩種美觀托槽在對(duì)變形鏈球菌附著能力影響的效果方面無(wú)差異。

綜上所述，氧化鋯陶瓷托槽對(duì)變形鏈球菌的影響與氧化鋁陶瓷托槽比較無(wú)差異，可供臨床進(jìn)一步研究。