吳曉峰

（青海省心腦血管病?？漆t(yī)院 心內(nèi)科，青海 西寧 810000）

目前，冠狀動(dòng)脈（以下簡(jiǎn)稱冠脈）疾病患者在介入治療時(shí)常伴有心律失常等不良反應(yīng)。其中，心房顫動(dòng)（atrial fibrillation, AF）是最常見的持續(xù)性心律失常，普通人群患病率為1%～2%[1-2]。AF患者的卒中風(fēng)險(xiǎn)較正常人群增加5倍，AF引起的缺血性卒中可能致命[3-6]。本研究將冠脈介入治療后發(fā)生/未發(fā)生AF患者各4例進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析這些樣本差異表達(dá)的樞紐基因與臨床表型（如AF等）之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2017年5月青海省心腦血管病?？漆t(yī)院收治的AF患者14例作為AF組，選取同期醫(yī)院收治的冠脈介入治療后未發(fā)生AF患者14例作為非AF組。兩組各4例患者的左心房組織用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，各10例患者的左心房組織用于基因表達(dá)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)錄測(cè)序患者中，房顫組男性3例，女性1例；平均年齡（62.5±3.7）歲；高血壓3例；非房顫組男性2例，女性2例；平均年齡（59.2±3.9）歲；高血壓1例。AF組與非AF組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批同意，患者均在知情同意書上簽字。

1.2 方法

1.2.1 高通量測(cè)序 深圳華大基因生物信息科技有限公司通過(guò)HiSeq 2000測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）完成了本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing, RNASeq）工作。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的前處理 利用TopHat v2.01軟件，比較參考基因和測(cè)序數(shù)據(jù)，通常狀況下序列的比對(duì)率要求＞90%[7]。以每百萬(wàn)讀段的堿基片段（fragments per kilo bases per million reads, FPKM）評(píng)估基因表達(dá)的水平[8]。

1.2.3 差異基因表達(dá)分析 首先將冠脈介入治療后兩組患者左心房組織的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，應(yīng)用Cufflinks v2.2.1軟件挖掘出錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（the false discovery rate, FDR）＜0.05的差異表達(dá)基因，每個(gè)差異表達(dá)基因經(jīng)校正后的顯著性=差異基因的P值×基因總數(shù)/最大P值對(duì)應(yīng)的排序號(hào)[9]。

1.2.4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（weighted gene co-expression network, WGCN）分析 運(yùn)用WGCN來(lái)分析差異表達(dá)基因[10]。本研究提到的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的定義為：1個(gè)基因由1個(gè)節(jié)點(diǎn)代表，在相同的基因網(wǎng)絡(luò)中，不同樣本有共性表達(dá)，通過(guò)其相關(guān)表達(dá)系數(shù)來(lái)衡量基因之間的共表達(dá)關(guān)系。①WGCN的建立：連接相關(guān)基因時(shí)，選擇權(quán)重的標(biāo)準(zhǔn)為p（i）～i-r，即連接數(shù)為i的概率p（i）與i的n次方成反比，并且服從無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布。對(duì)加權(quán)系數(shù)進(jìn)行選擇，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用過(guò)程中無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布。同時(shí)滿足以下條件：如果模塊不同，其中的基因平均連接度就高，這個(gè)節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生概率的對(duì)數(shù)值[log p（i）]和連接點(diǎn)個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)值[log（i）]呈負(fù)相關(guān)。②WGCN構(gòu)建的方法：冪指數(shù)鄰接函數(shù)被應(yīng)用于WGCN算法。應(yīng)用鄰接系數(shù)αmn這個(gè)指標(biāo)可以衡量任何基因?qū)Φ南嚓P(guān)性，也就是針對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行次方的冪指數(shù)加權(quán)：αmn=power（Smnβ）=|Smn|β。確定加權(quán)系數(shù)β要嚴(yán)格遵守?zé)o尺度網(wǎng)絡(luò)原則，指連接節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)取對(duì)數(shù)[log（k）]與節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)的概率的對(duì)數(shù)值[log p（k）]之間相關(guān)系數(shù)與0.8非常接近。把鄰接函數(shù)參數(shù)β確定好以后，隨后轉(zhuǎn)換相關(guān)矩陣S=|Smn|。③基因集模塊與表型信息的關(guān)聯(lián)：計(jì)算得到基因模塊特征值，再計(jì)算模塊的特征向量與關(guān)注表型的相關(guān)系數(shù)；對(duì)于分組表型數(shù)據(jù)（如疾病狀態(tài)等），可以首先定義用t-test計(jì)算每個(gè)基因在不同組（如疾病組和正常組）間基因比較有差異的P值，并將P值以10為底的對(duì)數(shù)值定義為基因顯著性，再將模塊內(nèi)所有基因顯著性值取平均數(shù)，該數(shù)值即為模塊的顯著性（module significant，MS）。MS值越高說(shuō)明這個(gè)模塊與疾病之間的關(guān)聯(lián)越高。④基因的顯著性也可以定義為某個(gè)基因表達(dá)譜與表型信息的相關(guān)性。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)樞紐基因的表達(dá)

用Trizol試劑裂解組織，提取總mRNA，使用日本TOYOBO公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說(shuō)明書操作，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)，ABI7300設(shè)置條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性2 s，60℃延伸30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增終止。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用R 2.39統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者差異表達(dá)基因分布

兩組患者左心房組織的比較中展示了差異表達(dá)基因FPKM層次聚類圖的分布情況，聚類方式選用歐氏距離法（見圖1）。本研究一共識(shí)別了824個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因314個(gè)，下調(diào)基因510個(gè)。

2.2 基因模塊的識(shí)別

通過(guò)動(dòng)態(tài)剪切樹法，本研究將824個(gè)差異表達(dá)基因用于WGCN分析，共識(shí)別18個(gè)基因模塊。對(duì)每個(gè)基因模塊的特征向量基因相似度進(jìn)行分析，最終得到了8個(gè)相似度較高的模塊（見圖2）。

圖1 兩組患者差異表達(dá)基因分布

圖2 基因模塊的識(shí)別

2.3 各基因模塊與臨床表型的相關(guān)性

紫色模塊與AF嚴(yán)重程度具有相關(guān)性（r=0.990，P=0.005）。見圖 3。

2.4 樞紐基因與AF嚴(yán)重程度的相關(guān)性

RCAN1和DNAJA4基因在紫色模塊中對(duì)AF的作用最強(qiáng)（均q=0.038）。見附表。

2.5 兩組患者RCAN1和DNAJA4基因相對(duì)表達(dá)量比較

AF組RCAN1基因相對(duì)表達(dá)量為（9.213±2.132），非AF組為（4.891±2.215），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.756，P=0.000），AF組高于未AF組。AF組DNAJA4基因相對(duì)表達(dá)量為（0.983±0.321），非 AF 組為（5.263±0.538），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.756，P=0.000），AF組低于未AF組。見圖4。

圖3 各基因模塊與臨床信息的相關(guān)性

附表 樞紐基因與AF嚴(yán)重程度的相關(guān)性參數(shù)

圖4 兩組患者RCAN1和DNAJA4基因表達(dá)量比較（n =4，±s）

3 討論

隨著高通量技術(shù)的快速發(fā)展及其在復(fù)雜性疾病研究中的廣泛應(yīng)用，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[11-14]。本研究對(duì)10例冠脈介入治療后發(fā)生AF患者以及10例冠脈介入治療后未發(fā)生AF患者的左心房組織進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序，并根據(jù)差異基因表達(dá)譜鑒定出與臨床表型相關(guān)的基因集模塊，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樞紐基因（RCAN1和DNAJA4）的表達(dá)變化與AF嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。

之前有研究表明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種細(xì)胞質(zhì)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白磷酸酶，通過(guò)與NFAT和L型Ca2+通道的相互作用刺激心臟肥大[15-16]。已知RCAN1可抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶及其相關(guān)途徑[17]。但有學(xué)者表明，當(dāng)高度表達(dá)并且因此增強(qiáng)肥大信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，RCAN1可以替代地用作鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活劑[18]。因此，RCAN1水平的攝動(dòng)（歸因于遺傳變異或突變）可能導(dǎo)致功能異常轉(zhuǎn)換，從而觸發(fā)心房重構(gòu)和心律失常發(fā)生。DNAJA4調(diào)節(jié)KCNH2鉀通道的運(yùn)輸和成熟，其在心臟復(fù)極化中具有重要作用，且涉及長(zhǎng)QT綜合征[19]。FHL2與許多細(xì)胞組分相互作用，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，轉(zhuǎn)錄機(jī)制和離子通道[20]。FHL2顯示增強(qiáng)異丙腎上腺素的肥大作用，表明FHL2可能調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。FHL2還與心臟中的幾種鉀通道如KCNQ1、KCNE1和KCNA5相互作用[21]。此外，血管心外膜物質(zhì)（blood vessel epicardial substance, BVES）和其家族其他成員被證明在心臟起搏細(xì)胞中高度表達(dá)。BVES敲除小鼠顯示竇性結(jié)節(jié)功能障礙，表明BVES調(diào)節(jié)心臟起搏和傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)展，因此可能參與AF的早期發(fā)展階段[22]。

本研究的幾個(gè)缺陷：首先，沒(méi)有足夠大的人類左心房mRNA數(shù)據(jù)集存在。因此，本研究使用獨(dú)立的數(shù)據(jù)集通過(guò)PCR方法驗(yàn)證RNA-Seq分析的結(jié)果，結(jié)果表明本研究識(shí)別的樞紐基因是可靠的。其次，缺少基因功能性試驗(yàn)，在后續(xù)的研究將深入探究該樞紐基因的功能驗(yàn)證。

總之，本研究運(yùn)用了新技術(shù)RNA-Seq對(duì)有無(wú)AF發(fā)生的左心房組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了WGCN分析，初步定位出冠脈介入治療后與AF有關(guān)的樞紐基因?yàn)镽CAN1和DNAJA4。后續(xù)將對(duì)上述基因?qū)嵤w內(nèi)外功能驗(yàn)證，進(jìn)一步闡明冠脈介入治療后與AF發(fā)生的機(jī)制并制定防治手段。