彭志鋒，劉穎，李晨旭

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，山西 大同 037009）

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病常見并發(fā)癥[1]。許多證據(jù)表明，脊髓背角（spinal dorsal horn, SDH）小膠質(zhì)細(xì)胞激活在病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[2-3]。以往研究表明，在脊髓神經(jīng)損傷模型中小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放趨化因子配體3（CC-chemokine ligand 3,CCL3）有助于誘導(dǎo)機(jī)械異常性疼痛[4]。大鼠鞘內(nèi)注射CCL3可產(chǎn)生機(jī)械痛覺過敏[5]。CCL3也可激活其同源受體CCR5和CCR1，鞘內(nèi)注射CCR5拮抗劑可減輕外周神經(jīng)損傷引起的疼痛過敏[5]。此外，嘌呤P2X7受體（purinoceptor P2X7 receptors, P2X7R）的表達(dá)也可促進(jìn)SDH小膠質(zhì)細(xì)胞釋放CCL3[6]。然而，脊髓CCL3和P2X7R在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究目的是探討脊髓CCL3和P2X7R在鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，體重180～200 g，購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（晉）2009～0001。室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度約為50%。12 h晝/夜循環(huán)照明，自由飲水和進(jìn)食。將SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和STZ組，每組25只。根據(jù)鞘內(nèi)注射藥物將STZ組進(jìn)一步分為CCL3組、IgG2A，以及A438079組、PBS組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重、空腹血糖和縮足閾值（paw withdrawal threshold, PWT）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 冷凍切片機(jī)（德國Leica公司，SM2010），STZ、A438079（P2X7R拮抗劑）、抗兔Alexa Fluor 488購自美國Sigma公司，Iba1抗體（美國Millipore公司），CCL3中和抗體、IgG2A購自南京多瑞斯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型的復(fù)制 用生理鹽水配置成2% STZ，大鼠腹腔單次注射65 mg/kg STZ[7]。檢測STZ腹腔注射1周后大鼠尾靜脈空腹葡萄糖水平及1個(gè)月后體重變化，對(duì)糖尿病發(fā)病進(jìn)行評(píng)估。糖尿病大鼠只有空腹血糖濃度＞240 mg/dl才可用于研究。測空腹血糖前大鼠禁食12 h，不禁水。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠鞘內(nèi)插管 采用1%戊巴比妥鈉（0.06 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸后部剪毛、消毒，在兩耳連線中央做縱向切口，暴露枕骨寰枕膜，插入10號(hào)PE管約6～7 cm至蛛網(wǎng)膜下池后固定。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉（8×105u/d），預(yù)防感染。STZ注射前1 d通過鞘內(nèi)注射CCL3中和抗體（4 ng/10μl，10μl）或?qū)φ?IgG2A，以及 A438079（1μg/10μl，10μl）或?qū)φ誔BS，1次/d，持續(xù) 7 d。

1.2.3 免疫熒光 采用10%水合氯醛（150～200 mg/kg）麻醉大鼠，PBS心臟灌注，將大鼠腰段脊髓L5部分取出，在4%多聚甲醛中過夜固定，在4℃冰箱內(nèi)通過20%和30%蔗糖溶液脫水，直至標(biāo)本沉底。用OCT包埋脫水的標(biāo)本，冷凍切片機(jī)切片厚約20μm。用 30 ml甲 醛、10 ml PBS、500μl 30% H2O2封 閉10 min，去除組織中內(nèi)源性過氧化物酶。兔源多克隆Iba1抗體（1∶1 000）室溫下孵育24 h，PBS洗凈后加入熒光標(biāo)記二抗Alexa Fluor 488，室溫孵育1 h。采用熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，SZ61GFP-D）計(jì)數(shù)SDH中Iba1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 行為學(xué)觀察 模型復(fù)制前，以及復(fù)制后1、3、5、7、14和21 d對(duì)大鼠進(jìn)行PWT測定。在行為學(xué)測試前，所有動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室≥2 h。采用1.0～15.0 g von Frey細(xì)絲垂直刺激大鼠后足中央處，持續(xù)5～10 s，出現(xiàn)明顯縮足、舔足及抬足行為為陽性反應(yīng)，結(jié)果重復(fù)3次，每次間隔5 min。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 通 過RNA提取試劑盒提取大鼠腰段脊髓L5背角總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RNA樣品14μl，反應(yīng)緩沖液4μl，酶混合物2μl），使用基因特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增（稀釋cDNA模板8μl，PCR引物2μl，SYBR?綠化染料10μl），引物序列見表1。通過分析軟件計(jì)算目的基因Ct，以GAPDH為內(nèi)參；按照文獻(xiàn)[8]計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量 =2-（ΔCt樣品-ΔCt對(duì)照）。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型復(fù)制成功

2.1.1 血糖 對(duì)照組大鼠血糖（80±10.5）mg/dl，STZ腹腔注射1周后，血糖水平增加至（250.0±30.8）mg/dl，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.361，P=0.006）。

2.1.2 體重 飼養(yǎng)1個(gè)月后，對(duì)照組大鼠體重（300±40.5）g，STZ組（260.0±35.2）g，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.834，P=0.032），STZ組大鼠體重減輕。

2.2 STZ誘導(dǎo)大鼠SDH小膠質(zhì)細(xì)胞激活

生理鹽水和STZ腹腔注射后7、14和21 d比較大鼠PWT，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的PWT有差別（F=17.058，P=0.003）；②對(duì)照組與STZ組的PWT有差別（F=30.735，P=0.000），對(duì)照組較STZ組的PWT高。③兩組PWT變化趨勢(shì)有差別（F=14.637，P=0.002）。見表2和圖1。

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWT比較 （n =25，g，±s）

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWT比較 （n =25，g，±s）

組別 0 d 7 d 1 4 d 2 1 d對(duì)照組 1 5.0±0.0 1 0.5±1.2 1 3.8±0.7 1 3.0±1.1 S T Z 組 1 5.0±0.0 3.0±0.4 3.9±0.3 7.0±1.4

圖1 兩組大鼠PWT的變化趨勢(shì) （n =25，±s）

對(duì)照組大鼠SDH中Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)（200.0±10.5）個(gè)；STZ處理后1、7和14 d的Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)分別為（194.0±3.0）、（400.0±23.0）和（300.0±16.8）個(gè)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.428，P=0.002）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，STZ處理后7和14 d的Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 STZ處理后大鼠SDH中的小膠質(zhì)細(xì)胞 （免疫熒光）

圖3 各組大鼠Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較（n =25，±s）

2.3 CCR1、CCL3和CCR5 mRNA表達(dá)的變化

2.3.1 CCR1 mRNA 對(duì)照組大鼠SDH中CCR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.0±0.3）；STZ處理1、3、7和14 d后大鼠CCR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.2±0.5）、（1.4±0.3）、（0.9±0.5）和（1.6±0.1），經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.538，P=0.087）。見圖4。

2.3.2 CCL3 mRNA 對(duì)照組大鼠SDH中CCL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.0±0.5）；STZ處理 0、3、7和14天后大鼠CCL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.1±1.3）、（4.0±1.6）、（16.0±1.4）和（9.0±0.9），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.846，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，STZ處理7和14天后大鼠CCL3 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖 5。

圖4 各組大鼠CCR1 mRNA表達(dá)水平比較（n =25，±s）

圖5 各組大鼠CCL3 mRNA表達(dá)水平比較（n =25，±s）

2.3.3 CCR5 mRNA 對(duì)照組大鼠SDH中CCR5 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.0±0.2）；STZ處理 1、3、7和14 d后大鼠CCR5 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.1±0.4）、（1.3±0.2）、（2.5±0.1） 和（2.0±0.2），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.052，P=0.008）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，STZ處理7和14 d后大鼠CCR5 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖 6。

2.4 CCL3抗體對(duì)STZ處理大鼠PWT的影響

CCL3與IgG2A鞘內(nèi)注射后第0、1、3、5和7天大鼠PWT比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的PWT有差別（F=18.735，P=0.001）；②兩組大鼠 PWT有差別（F=35.836，P=0.000），CCL3組較IgG2A組的PWT高；③兩組PWT變化趨勢(shì)有差別（F=16.952，P=0.001）。見表3和圖7。

圖6 各組大鼠CCR5 mRNA表達(dá)水平比較（n =25，±s）

表3 IgG2A組和CCL3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PWT比較（n =5，g，±s）

表3 IgG2A組和CCL3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PWT比較（n =5，g，±s）

I gG2A組 15.0±0.0 12.2±1.4 6.0±1.3 2.6±0.1 10.3±1.5

圖7 IgG2A組和CCL3組大鼠PWT的變化趨勢(shì)（n =25，±s）

2.5 P2X7R在STZ誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺過敏中的作用

qRT-PCR結(jié)果顯示，STZ處理7 d后大鼠SDH中P2X7R mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.2±0.5），而對(duì)照組為（1.0±0.1），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.752，P=0.005），STZ組大鼠P2X7R mRNA表達(dá)水平升高。見圖8。

A438079與PBS處理0、1、3、5和7 d后測量大鼠PWT比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間PWT有差別（F=20.560，P=0.001）；② 兩 組 大 鼠 PWT有 差 別（F=40.821，P=0.000），A438079組較對(duì)照組PWT值高；③兩組大鼠PWT變化趨勢(shì)有差別（F=14.752，P=0.001）。見表4和圖9。

圖8 各組大鼠P2X7R mRNA表達(dá)水平比較（n =25，±s）

表4 PBS組和A438079組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PWT比較（n =5，g，±s）

表4 PBS組和A438079組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PWT比較（n =5，g，±s）

P BS 組 14.0±0.0 12.1±0.0 7.3±0.3 5.4±0.5 2.5±0.0

圖9 PBS組和A438079組大鼠PWT的變化趨勢(shì)（n =5，g，±s）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)重復(fù)給予CCL3中和抗體可抑制STZ誘導(dǎo)的痛覺過敏，提示CCL3在STZ處理引起的大鼠機(jī)械性痛覺過敏中起關(guān)鍵作用。盡管STZ處理大鼠SDH中CCL3表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞類型仍不明確，但是本研究證實(shí)，SDH中CCL3表達(dá)上調(diào)與小膠質(zhì)細(xì)胞增加有關(guān)系。此外，免疫熒光結(jié)果也顯示，STZ處理后大鼠SDH小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)肥大及數(shù)量增加，均是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的特征。以往研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞可合成和釋放CCL3[6]。最近一項(xiàng)體外培養(yǎng)大鼠腦切片研究結(jié)果表明，腦切片神經(jīng)元損傷后可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生CCL3[9]。也有研究證實(shí)，大鼠創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中CCL3表達(dá)上調(diào)[4]。上述結(jié)果均提示，CCL3可能來源于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。P2X7受體是一種2次跨膜蛋白，包含595個(gè)氨基酸殘基。P2X7R活化后可促進(jìn)IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α和一氧化氮等的釋放，在炎癥、疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用[10]。此外，P2X7R活化后也可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放CCL3[6]。本研究結(jié)果表明，A438079阻斷脊髓P2X7R可抑制STZ誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏，其效果與CCL3中和抗體類似。大鼠外傷性神經(jīng)損傷后，SDH小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X7受體表達(dá)上調(diào)[11]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞可能是STZ處理大鼠SDH中CCL3的來源。然而，本實(shí)驗(yàn)不能排除其他膠質(zhì)細(xì)胞也可能釋放CCL3，因?yàn)槌诵∧z質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞也可表達(dá)CCL3[12]。最近研究提示，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在化療所致機(jī)械性痛覺過敏發(fā)揮作用[13]。

本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射CCL3中和抗體或選擇性P2X7R拮抗劑——A438079均可抑制STZ處理引起的機(jī)械痛覺過敏。雖然CCL3介導(dǎo)STZ誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺過敏機(jī)制不明確，但是CCL3可能影響脊髓疼痛信號(hào)的傳遞。研究證實(shí)，鞘內(nèi)注射CCL3后，動(dòng)物可產(chǎn)生機(jī)械刺激痛覺過敏的反應(yīng)[14]。SDH中CCR5表達(dá)明顯上調(diào)，與之相匹配的是CCL3表達(dá)。CCR5在神經(jīng)病理痛模型痛覺過敏中發(fā)揮作用[10]。神經(jīng)損傷后脊髓激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)CCR5[15]。另一方面，STZ處理大鼠SDH中CCR1表達(dá)缺乏變化。雖然以往研究報(bào)道，外傷性神經(jīng)損傷后脊髓CCR1表達(dá)上調(diào)[16]，但是其差異可能是由于大鼠疼痛模型及檢測時(shí)間不同。

總之，CCL3和P2X7R在STZ誘導(dǎo)的大鼠機(jī)械性痛覺過敏中起重要作用。本研究結(jié)果不僅為STZ誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病變提供新的機(jī)制，而且為神經(jīng)病理性疼痛治療提供新的靶點(diǎn)。