王迎春 王曉亞 麻景梅 牛麗穎

摘要：目的??建立夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價方法，并對夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行相關(guān)性研究。方法??采用HPLC測定15批夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸和迷迭香酸的含量，計算轉(zhuǎn)移率、出膏率;采用超高液相色譜法建立夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果??15批夏枯草飲片中咖啡酸和迷迭香酸的含量分別為0.11～0.26 mg/g和2.35～7.57 mg/g，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸和迷迭香酸的含量分別為3.32～4.11 mg/g和8.34～32.83 mg/g。咖啡酸轉(zhuǎn)移率為151.6%～260.6%，平均（193.6±58.1）%;迷迭香酸轉(zhuǎn)移率為28.3%～58.1%，平均（47.0±14.1）%;出膏率為9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜分別有7個共有峰，對比兩者對照指紋圖譜，共6個共有峰。結(jié)論??15批夏枯草飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分基本一致，建立的質(zhì)量評價方法可用于標(biāo)準(zhǔn)湯劑及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：夏枯草;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;飲片;指紋圖譜;相關(guān)性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.017

中圖分類號：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0079-05

Correlation Study on?Quality Evaluation of Decoction Pieces and Standard Decoction of Prunellae?Spica

WANG Ying-chun， WANG Xiao-ya， MA Jing-mei， NIU Li-ying

Hebei University of Chinese Medicine， Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology; Research Center， TCM Formula Granule Research Center of Hebei Province University， Shijiazhuang 050091， China

Abstract： Objective?To establish the quality evaluation method for standard decoction of?Prunellae?Spica; To conduct the correlation study on?decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica. Methods?The contents?of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of?decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica?were determined by HPLC，?and?the transfer rate and the extractum rate?were calculated. The fingerprints of decoction pieces and standard decoction were evaluated by UPLC and the correlations among them were evaluated. Results?The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of decoction pieces were in the range of 0.11–0.26?mg/g and 2.35–7.57?mg/g. The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of standard decoction were in the range of 3.32–4.11 mg/g and 8.34–32.83 mg/g. The transfer rate of caffeic acid was in the range of 151.6%–260.6%， and the average transfer rate was （193.6±58.1）%. The transfer rate of rosemary acid was in the range of 28.3%–58.1%， and the average transfer rate was （47.0±14.1）%. The extractum rate was in the range of 9.1%–12.9%， and the average extractum rate was （10.8±3.2）%. Seven common peaks were confirmed in the fingerprints of decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica. Compared the two reference fingerprints， there were six common peaks. Conclusion?The main chemical constituents of decoction pieces?and standard decoction of Prunellae?Spica?are basically identical. The established quality evaluation method can be used for quality control of standard decoction and related preparations.

Keywords：Prunellae?Spica; standard decoction; decoction?pieces; fingerprint; correlation

隨著中藥飲片形式的不斷革新，配方顆粒、破壁飲片等多種現(xiàn)代中藥劑型不斷出現(xiàn)，彌補了傳統(tǒng)中藥飲片攜帶不便、煎煮耗時等缺陷。但由于各生產(chǎn)企業(yè)所用中藥飲片來源及生產(chǎn)工藝各異，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管，市場上現(xiàn)代中藥劑型普遍存在質(zhì)量不均一、劑量不統(tǒng)一等問題^[1]。2016年，國家藥典委員會發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，提出將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)的單味飲片水煎劑，可作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，標(biāo)化新型中藥制劑，保證其質(zhì)量穩(wěn)定、均一，確保臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性^[2]。

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris?L.的干燥果穗，味辛、苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫的功效^[3]?，F(xiàn)代研究表明，夏枯草具有降血壓、降血糖、抗菌、抗氧化、抗病毒及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)等作用，臨床應(yīng)用較為廣泛^[4-7]。本研究選用6個不同產(chǎn)地的15批夏枯草飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定并分析夏枯草飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中有效成分的含量及其變化，計算轉(zhuǎn)移率和出膏率;建立夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的超高液相色譜指紋圖譜，對二者的相關(guān)性進(jìn)行研究，為夏枯草水煎液相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 ?儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC-15C泵，SPD-15C型紫外檢測器，SIL-10AF自動進(jìn)樣器，CTO-15C柱溫箱，島津LC色譜工作站（日本島津）;超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測器），Empower3色譜工作站（美國沃特世公司）;TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平（賽多利斯）;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;FD-1C-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

15批夏枯草飲片，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，產(chǎn)地分別為江蘇、浙江、湖南、湖北、河南、安徽，經(jīng)神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)檢中心檢測，符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）夏枯草項下有關(guān)規(guī)定;咖啡酸對照品（批號110885-200102）、迷迭香酸對照品（批號111871-201505），中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純、水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?溶液的制備

2.1.1 ?夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑

取夏枯草飲片100 g，煎煮2次。一煎加水16倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min;二煎加水12倍，武火沸騰，文火保持微沸15 min，趁熱用100目篩網(wǎng)分離煎液。合并煎液，迅速冷卻，60 ℃真空減壓濃縮至200 mL左右，冷凍干燥，得干膏粉。

2.1.2 ?對照品溶液

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸對照品適量，加50%乙醇制成每l mL含10.05 ?g咖啡酸、52.55 ?g迷迭香酸的溶液，即得。

2.1.3 ?供試品溶液

2.1.3.1 ?標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液

取干膏粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.1.3.2 ?飲片供試品溶液

取15批飲片粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.2 ?咖啡酸和迷迭香酸含量測定

2.2.1 ?色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.1%磷酸為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，75%～68%A;5～10 min，68%～65%A;10～15 min，65%～62%A;15～25 min，62%～60%A;25～35 min，60%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：330 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 ?方法學(xué)考察

2.2.2.1 ?線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以咖啡酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明咖啡酸在0.020 1～0.201 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=5.567 1×10⁶X+5.234 9×10³，r=0.999 8;以迷迭香酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明迷迭香酸在0.105 1～1.051 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.807 1×10⁶X+1.173 1×10⁴，r=0.999 8。2.2.2.2 ?精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸峰面積RSD分別為0.5%和0.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3 ?穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一批干膏粉約0.1 g，按“2.1.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、7、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸峰面積RSD分別為1.21%和1.09%，表明夏枯草供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.4 ?重復(fù)性試驗

精密稱取同一批干膏粉6份，每份約0.1 g，按“2.1.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸含量RSD值分別為1.88%和1.26%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 ?加樣回收率試驗

取同一批干膏粉6份，每份約0.05 g，精密稱定。精密加入一定體積的咖啡酸、迷迭香酸對照品溶液，按“2.1.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，每份平行測定2次，結(jié)果咖啡酸、迷迭香酸的平均回收率分別為100.47%、101.86%，表明本方法可用于咖啡酸和迷迭香酸含量的準(zhǔn)確測定，結(jié)果見表1。

2.2.3 ?樣品含量測定

按“2.2.1”項下色譜條件，分別測定15批夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液中咖啡酸和迷迭香酸的含量。

2.3 ?標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率測定

取“2.1.1”項下干膏粉，稱定質(zhì)量，計算標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。出膏率（%）=干膏質(zhì)量÷飲片質(zhì)量×100%。結(jié)果15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。分別將飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸及迷迭香酸含量測定結(jié)果代入公式，計算轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率（%）=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分含量÷飲片中指標(biāo)成分含量×100%。結(jié)果咖啡酸的轉(zhuǎn)移率為151.6%～260.6%，平均為（193.6±58.1）%;迷迭香酸的轉(zhuǎn)移率為28.3%～58.1%，平均為（47.0±14.1）%。見表2。

2.4 ?超高液相色譜指紋圖譜測定

2.4.1 ?色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;以0.1%磷酸為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，90%～83%A;5～6 min，83%～80%A;6～15 min，80%～70%A;15～16 min，70%～20%A;16～19 min，20%A）;流速：0.3 mL/min;檢測波長：210 nm;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：1 μL。

2.4.2 ?方法學(xué)考察

2.4.2.1 ?精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.2 ?重復(fù)性試驗

取同一樣品，按“2.1.3.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.2.3 ?穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按“2.4.1”項下色譜條件測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 ?指紋圖譜采集與分析

分別精密吸取15批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.4.1”項下色譜條件測定，得到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC指紋圖譜，見圖1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行色譜峰匹配，計算相似度，結(jié)果見表3。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相似度均在0.95以上。經(jīng)比較分析，確定共有7個共有峰，以迷迭香酸峰（6號）作為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明，相對保留時間RSD<1.19%，相對峰面積RSD介于24.31%～50.12%。

采用相同方法采集夏枯草飲片的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評價，色譜圖見圖2，相似度見表3。15批飲片指紋圖譜的相似度均在0.90以上。經(jīng)比較分析，確定共有7個共有峰，以迷迭香酸作為參照，各共有峰的相對保留時間RSD<1.35%，相對峰面積RSD介于21.39%～44.03%，說明不同產(chǎn)地、不同批次樣品的成分含量差異較大

2.4.4 ?相關(guān)性分析

????將夏枯草飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜進(jìn)行對比，見圖3。飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑有6個共有特征峰，其中3號為咖啡酸，6號為迷迭香酸。采用相似度評價軟件計算二者相似度，結(jié)果見表4。相似度>0.9，表明二者主要成分基本一致。

3 ?討論

本試驗所用15批夏枯草藥材來源于6個不同產(chǎn)地，具有較好的代表性。本試驗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備參照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號）和國家藥典委員會公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，以出膏率、有效成分含量及轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝進(jìn)行評價。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸的轉(zhuǎn)移率均>100%，可能在制備過程中存在物質(zhì)轉(zhuǎn)化，需要進(jìn)一步研究。

本次含量測定及指紋圖譜試驗過程中分別考察了不同的流動相及檢測波長，通過比較色譜峰數(shù)目、峰形及分離效果、出峰時間等因素確定最佳色譜條件。供試品制備方法分別考察了提取時間和提取溶劑對提取效果的影響，最終確定用50%乙醇超聲10 min進(jìn)行提取。

本試驗明確了夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝相應(yīng)參數(shù)，并對15批夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量及指紋圖譜進(jìn)行了相關(guān)性研究。從結(jié)果可以看出，標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片的化學(xué)成分基本相同，通過標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備的各批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較高的均一性，質(zhì)量相對穩(wěn)定，可作為配方顆粒質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)參照物。本試驗建立的夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法穩(wěn)定，可為夏枯草配方顆粒的研究及生產(chǎn)提供基本的數(shù)據(jù)支持。

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