王萌 張會存 劉欣 汪紅兵

摘要：目的 ?觀察參苓白術(shù)散對非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）模型大鼠血脂、瘦素和胰島素抵抗的影響，探討其相關(guān)作用機制。方法 ?20只實驗大鼠隨機分為正常組5只（正常飼料喂養(yǎng)）和高脂飲食組15只，高脂飲食組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)制作NAFLD模型，將成模大鼠隨機分為模型組、參苓白術(shù)散組和吡格列酮組，每組5只，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，參苓白術(shù)散組給予參苓白術(shù)散水煎液灌胃，吡格列酮組給予吡格列酮混懸液灌胃。藥物干預(yù)8周后進行口服葡萄糖耐量實驗，檢測大鼠糖耐量變化及血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素與胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)。結(jié)果??與正常組比較，模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素、胰島素、血糖和胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，參苓白術(shù)散組和吡格列酮組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素、胰島素、血糖和胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論??參苓白術(shù)散通過降低模型大鼠轉(zhuǎn)氨酶與血脂水平發(fā)揮治療NAFLD作用，其機制可能與調(diào)節(jié)瘦素、改善胰島素抵抗有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參苓白術(shù)散;胰島素抵抗;瘦素;血脂;肝功能;大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.009

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0035-05

Effects of Shenling Baizhu?Powder on Leptin and Insulin Resistance?ofNon-alcoholic Fatty Liver Disease Rats

WANG Meng¹， ZHANG Hui-cun²， LIU Xin²， WANG Hong-bing²

1. Medical School of Xianyang?Vocational Technical College，?Xianyang?712000， China; 2.?Beijing?Traditional Chinese Medicine Hospital， Capital Medical University， Beijing Institute of Chinese Medicine，?Beijing 100010， China.

Abstract：?Objective?To observe the effects of Shenling Baizhu Powder on blood lipid， leptin and insulin resistance of non-alcoholic fatty liver disease?（NAFLD）?rats; To explore its mechanism. Methods Twenty?rats were randomly divided into normal group （normal diet?feed，?n=5） and high-fatdiet group （high-fat diet feed，?n=15）. Rats of high-fat diet group?were fed with high-fat diet to establish NAFLD model. Model rats?were divided into model group， Shenling Baizhu?Powder group and pioglitazone group， with 5 rats in each group. Normal group and model group were given normal saline for gavage， while Shenling Baizhu?Powder group and pioglitazone group were given Shenling Baizhu Powder and pioglitazone suspension by intragastric administration respectively. After 8 weeks of medicine intervention， all rats were subjected to oral glucose tolerance test.?Serum?transaminase， blood lipid， leptin and insulin levels were detected by biochemical analysis. Insulin resistance index was calculated. Results?Compared with the normal group，?serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index?increased significantly in the model group （P<0.05）. Compared with the model group，?serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index in Shenling Baizhu?Powder and pioglitazone group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion?Shenling Baizhu?Powder can conduct treatment of NAFLD by reducing the effects of transaminase and lipid levels in model rats， and the mechanism may be related to the regulation of leptin and the improvement of insulin resistance.

???Keywords： Shenling Baizhu Powder; insulin resistance; leptim; blood lipids; liver function; rats

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fat liver disease，NAFLD）患病率逐年升高，已成為慢性肝病和肝酶學異常的首要病因。有研究表明，NAFLD相關(guān)肝硬化的肝癌發(fā)生率與丙型肝炎相關(guān)肝硬化的肝癌發(fā)病率接近^[1]。NAFLD是隱源性肝硬化的重要原因之一，由于該病患病率高，病變遷延，且危害大，是目前國內(nèi)外肝病界研究的熱點之一^[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD伴有高胰島素血癥和胰島素抵抗（insulin resistance，IR），并與機體對瘦素的敏感性降低有關(guān)^[6]。白色脂肪分泌的多肽瘦素，其主要生理功能是調(diào)節(jié)糖脂代謝，主要影響機體攝食與能量代謝。當機體攝入脂肪時，機體分泌廋素增加，在下丘腦部位，通過JAK-STAT通路產(chǎn)生抑制神經(jīng)肽Y，減少進食并興奮交感神經(jīng)分解脂肪，調(diào)控能量代謝。但在NAFLD病理狀態(tài)下，瘦素異常導致高胰島素血癥，游離脂肪酸增加，肝臟分解脂肪酸失代償，最終引起肝臟的脂質(zhì)沉積，形成脂肪肝^[7]。瘦素可抑制胰島素分泌，而當胰島素分泌增多，可反饋性促進瘦素分泌，調(diào)控糖、脂代謝。但當瘦素與胰島素之間的調(diào)節(jié)發(fā)生異常，IR發(fā)生，糖脂代謝發(fā)生紊亂，肝臟攝取過量的脂肪酸，脂肪在肝臟的異常堆積及炎性細胞聚集、浸潤，導致NAFLD發(fā)生^[8-9]。有文獻報道，參苓白術(shù)散可有效作用于糖尿病患者胰島素信號通路，緩解其IR^[10-12]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)制作NAFLD大鼠模型，觀察參苓白術(shù)散對NAFLD大鼠IR與瘦素的影響，探討其治療NAFLD可能的作用機制。

1 ?實驗材料

1.1 ?動物及飼料

清潔級SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量110～120 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2009-0012。飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所清潔級動物房。高脂飼料（蛋白質(zhì)27.5%，碳水化合物65.8%，脂肪11.4% kCal/g），北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作。

1.2 ?藥物

參苓白術(shù)散（人參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，炙甘草9 g）^[13]，飲片由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，將上述飲片放入涼蒸餾水中，浸泡30 min，煎煮2次，將藥汁混合后過濾，濃縮至每1 mL含原藥材1 g，離心去掉殘渣，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。吡格列酮片，天津武田藥品有限公司，批?55A，使用前充分研磨，0.5%羧甲基纖維素納溶液配制成作混懸液。用藥劑量按實驗動物與人體體表面積比等效量換算。

1.3 ?主要試劑與儀器

肝功能、血脂試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司），胰島素放免試劑盒（北京華英生物），瘦素ELISA試劑盒（博奧森生物工程有限公司）。血糖儀（美國強生），7160全自動生化儀（日本日立），酶標儀（美國Bio-Rad），γ-911放射免疫分析儀（中國科技大學實業(yè)總公司）。

2 ?實驗方法

2.1 ?分組、造模和給藥

實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、吡格列酮組、參苓白術(shù)散組，每組5只。參考文獻[14-15]方法造模，正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其余3組大鼠飼喂高脂飼料，連續(xù)8周，制作大鼠NAFLD模型。參苓白術(shù)散組大鼠給予參苓白術(shù)散水煎液（12 g/kg）灌胃，吡格列酮組大鼠給予吡格列酮混懸液（4 mg/kg）灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為5 mL/kg，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 ?口服葡萄糖耐量實驗

給藥8周后，各組大鼠禁食12～14 h后，剪尾采血測定空腹血糖（FPG），然后以2 g/kg葡萄糖標準灌胃，分別于灌胃后60、120 min大鼠尾靜脈取血檢測血糖。

2.3 ?取材

給藥8周后，予3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置120 min，2000 r/min離心15 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。

2.4 ?血清肝功能、血脂測定

取實驗大鼠備用血清，分別與蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、L-天門冬氨酸，α-酮戊二酸、L-丙氨酸化學反應(yīng)保溫1?min，測定340?nm外吸光度，獲得各組血清轉(zhuǎn)氨酶值。使用7160全自動生化儀，按血脂試劑盒說明書測定大鼠三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.5 ?血清胰島素測定

加入聚苯乙烯試管并相應(yīng)編號后，分別加各組實驗大鼠血清及標準品各100 μL，各管分別加入胰島素抗體100?μL與I¹²⁵標記胰島素100?μL， 4 ℃混勻，反應(yīng)24 h;加分離劑500?μL，4?℃、3500?r/min離心15 min，吸棄上清液，應(yīng)用γ-911放射免疫分析儀自動檢測沉淀的CPM值，并根據(jù)標準曲線計算各組大鼠血清胰島素（FINS）水平。

2.6 ?血清瘦素測定

①將各種試劑移至室溫平衡30 min，取濃縮洗滌液，根據(jù)當批檢測數(shù)量，用蒸餾水1∶20稀釋，混勻后備用。②標準品及質(zhì)控品第1次使用前用0.5 mL蒸餾水溶解后充分搖勻，靜置10 min后使用。③將預(yù)包被板從密封袋中取出，設(shè)空白對照孔，不加任何液體;每個校準點依次各設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)標準品50 μL;其余檢測孔直接加質(zhì)控品或待測血清50 μL。然后各孔加入酶標抗體50 μL，充分混勻，貼上封板膜，置于37 ℃溫育1 h。④手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置10 s甩干，重復3次后拍干;洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。⑤每孔加顯色劑A液50 μL，顯色劑B液50 μL，振蕩混勻，置于37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL。⑥用酶標儀讀數(shù)，先用空白對照孔調(diào)零點，然后測定各孔吸光度，計算樣品濃度。

2.7 ?胰島素抵抗指數(shù)計算

根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型HOMA，計算IR指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）÷22.5。

3 ?統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以 x（—）±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?參苓白術(shù)散對模型大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清ALT、AST水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 ?參苓白術(shù)散對模型大鼠血清血脂水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清TG、TC與LDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但對HDL-C影響不明顯。結(jié)果見表2。

4.3 ?參苓白術(shù)散對模型大鼠血清胰島素和瘦素水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清FINS、瘦素水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清FINS、瘦素水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.4 ?參苓白術(shù)散對模型大鼠口服葡萄糖耐量實驗的影響

與正常組比較，模型組大鼠血糖60、120 min時均升高，120 min時血糖差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血糖60 min變化不明顯，120 min時吡格列酮組和參苓白術(shù)散組血糖明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表4。

4.5 ?參苓白術(shù)散對模型大鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠HOMA-IR顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表5。

5 ?討論

NAFLD患者肝臟存在IR，構(gòu)成了NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)并與NAFLD的病情進展緊密關(guān)聯(lián)^[16]。瘦素是由機體的肥胖基因（Ob基因）經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯表達形成的脂肪源性激素，該激素通過分布于中樞與外周的瘦素受體蛋白，調(diào)控脂肪代謝及能量消耗^[17]，當NAFLD瘦素水平異常升高可導致IR，該生理現(xiàn)象稱為瘦素抵抗，IR和瘦素抵抗共同促進了NAFLD疾病的發(fā)生與發(fā)展。瘦素抵抗在NAFLD發(fā)病中具有重要作用^[18-19]。NAFLD患者表現(xiàn)出血清瘦素水平升高與瘦素抵抗的病理表現(xiàn)，表明血清瘦素水平可幫助臨床早期診斷NAFLD，臨床實踐中也發(fā)現(xiàn)，改善瘦素抵抗藥物亦可改善IR，阻止NAFLD病情的發(fā)展，NAFLD患者瘦素水平與胰島素抵抗指數(shù)呈獨立正相關(guān)^[20]。

脂肪組織經(jīng)胰島素刺激后，高表達瘦素并控制飲食，當抑制胰島素分泌，降低胰島素，可顯著減少瘦素的形成。同時瘦素可促進分解TG，形成游離脂肪酸（FFA），F(xiàn)FA影響肌肉對胰島素的敏感及肝糖輸出，并降低對胰島素的滅活，F(xiàn)FA可刺激胰島分泌胰島素，形成高胰島素血癥與IR^[21-24]。

中醫(yī)學認為NAFLD病因與嗜食肥甘厚味、多逸少勞有關(guān)，其病位在肝，與脾、腎等臟腑密切相關(guān)，由脾、腎、肝三臟功能失調(diào)，痰瘀互結(jié)，停積于肝所致。脾虛痰瘀為NAFLD主要病機。

參苓白術(shù)散中人參大補脾胃之氣，白術(shù)、茯苓健脾滲濕，山藥、蓮子健脾兼以澀腸止瀉，白扁豆、薏苡仁健脾化濕，砂仁芳香醒脾，暢達氣機，桔梗通利水道、且能載藥上行，炙甘草健脾和中，調(diào)和藥性，諸藥相合，可補脾胃祛痰飲，有效緩解機體水濕停聚，降低肝糖原的減少，改善糖代謝。本實驗結(jié)果顯示，NAFLD大鼠經(jīng)高脂飼料誘導后，其肝功能和血脂出現(xiàn)異常，表明高脂飼料對肝臟造成一定損傷，NAFLD造模成功?？诜咸烟悄土繉嶒灲Y(jié)果顯示，葡萄糖灌胃大鼠120 min后檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血糖升高，表明高脂飼料對大鼠胰島素信號通路產(chǎn)生影響，經(jīng)參苓白術(shù)散和吡格列酮干預(yù)后，與模型組比較，各給藥組大鼠120 min血糖顯著降低，表明參苓白術(shù)散和吡格列酮均可顯著改善高脂造成的糖耐量降低及其誘發(fā)的IR;NAFLD大鼠經(jīng)吡格列酮和參苓白術(shù)散干預(yù)后，血脂、瘦素、血糖與HOMA-IR均顯著改善。

綜上，參苓白術(shù)散通過降低模型大鼠轉(zhuǎn)氨酶與血脂水平發(fā)揮治療NAFLD作用，其機制可能與調(diào)節(jié)瘦素、改善IR有關(guān)，其具體機制有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 范建高.非酒精性脂肪性肝病的研究現(xiàn)狀與展望[J].臨床肝膽病雜志，2015，31（7）：999-1001.

[2]?FRIEDMAN?S?L， NEUSCHWANDER TETRI?B?A， RINELLA?M，?et al. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies[J]. Nat Med，2018，24（7）：908-922.

[3]?NATH P， SINGH?S P. Nonalcoholic fatty liver disease：Time to take the bull by the horns[J]. Euroasian J Hepatogastroenterol. 2018，8（1）：47-51.

[4] 張會存，尚菊菊，王寧，等.益氣養(yǎng)陰方對非酒精性脂肪性肝病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（12）：47-49.

[5] 吳利春，涂浩，段麗，等.木瓜提取物對高糖高脂誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24（5）：48-51.

[6]?El-KADER?S M A， Al-SHREEF?F M， Al-JIFFRI?O H. Biochemical parameters response to weight loss in patients with non-alcoholic steatohepatitis[J]. Afr Health Sci，2016，16（1）： 242–249.

[7]?HIGUCHI H， HASEGAWA?A， YAMAGUCHI?T. Transcriptional regulation of neuronal genes and its effect on neural functions： transcriptional regulation of neuropeptide Y gene by leptin and its effect on feeding[J]. J Pharmacol Sci，2005，98（3）：225-231.

[8]?SEUFERT J， KIEFFER?T?J， HABENER?J?F.?Leptin inhibits insulin gene transcription and reverses hyperinsulinemia in leptin-?deficient ob/ob mice1[J].?Medical?Sciences，1999，96：674-679.

[9] JOU J，?ChOI?S?S，?DIEHL?A?M. Mechanisms of disease progression in nonalcoholic fatty liver disease[J]. SEMIN Liver Dis，2008，?28（4）：370-379.

[10] 龔英，沈玉國，李凱利，等.參苓白術(shù)散加減聯(lián)合二甲雙胍治療脾虛痰瘀型2型糖尿病臨床觀察[J].新疆中醫(yī)藥，2012，30（6）：19-21.

[11] 馬寧寧.參苓白術(shù)散加減治療肥胖型2型糖尿病脾虛濕困證的療效觀察[J].中醫(yī)藥導報，2017，23（12）：74-76.

[12] 徐小娟，劉丹，張煒寧，等.參苓白術(shù)散加減對2型糖尿病患者胰島素敏感指數(shù)的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2015，27（7）：954-956.

[13] 李冀，連建偉.方劑學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2016：123-124.

[14] 葉放，趙文霞，苗明三，等.化痰泄?jié)岱綄χ靖文Ｐ痛笫笠葝u素抵抗及瘦素的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2005，3（4）：290-293.

[15] 王倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進[J].世界華人消化雜志，2007，15（11）：1219-1224.

[16]?SWEET P?H， KHOO?T， NGUYEN?S. Nonalcoholic Fatty Liver Disease[J]. Prim Care，2017，44（4）：599-607.

[17]?POLYZOS?S?A， KOUNTOURAS?J， MANTZOROS?C?S.?Leptin?in non-alcoholic fatty liver disease：a narrative review[J]. Metabolism，2015， 64（1）：60-78.

[18]?BOUTARI C， PERAKAKIS?N， MANTZOROS?C?S. Association of dipokines with development and progression of nonalcoholic fatty liver disease[J]. Endocrinol Metab （Seoul），2018，33（1）：33-43.

[19]?RODRIGUEZ-ECHEVARRIA?R， MACIAS-BARRAGAN?J， PARRA-VARGAS?M，?et al. Diet switch and omega-3 hydroxy-fatty acids display differential hepatoprotective effects in an obesity/nonalcoholic fatty liver disease model in mice[J]. World J Gastroenterol， 2018，24（4）：461-474.

[20]?POLYZOS S?A，?KOUNTOURAS?J，?ZAVOS?C. Nonalcoholic fatty liver disease：the pathogenetic roles of insulin resistance and adipocytokines[J]. Curr?Mol Med，2009，9（3）：299-314.

[21] ALHASSON F， SETH?R?K， SARKAR?S，?et al. High circulatory leptin mediated NOX-2-peroxynitrite-miR21 axis activate mesangial cells and promotes renal inflammatory pathology in nonalcoholic fatty liver disease[J].?Redox Biol，2018，17：1-15.

[22]?VENIAMINOVA E， CESPUGLIO?R， CHEUNG?C?W，?et al. Autism-like behaviours and memory deficits result from a western diet in mice[J]. Neural Plast，2017，2017：9498247.

[23]?VALENTINI D， ALISI?A， DI?CAMILLO?C，?et al. Nonalcoholic fatty liver disease in italian children with down syndrome：prevalence and correlation with obesity-related features[J]. J Pediatr， 2017，189：92-97.

[24]?POLYZOS S?A， KOUNTOURAS?J， ZAVOS?C， et al. The potential adverse role of leptin resistance in nonalcoholic fatty liver disease：A hypothesis based on critical review of literature[J]. Clin Gastroenterol，2010，45（1）：50-54.