姜方毅 陳桂明 瞿玉興 夏圣

1江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室/醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所（江蘇鎮(zhèn)江 212013）；2高郵市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇高郵 225600）；3常州市中醫(yī)院骨科（江蘇常州 213000）

骨髓瘤是一種骨髓中出現(xiàn)單克隆漿細(xì)胞大量增多的惡性血液疾病，以骨痛、腎功能不全、貧血、高鈣血等癥狀為特征，發(fā)病率約為血液系統(tǒng)腫瘤的十分之一［1］。近年來(lái)，隨著不少免疫調(diào)節(jié)藥物及蛋白酶抑制劑的問(wèn)世，骨髓瘤患者預(yù)后得到明顯改善，但老年骨髓瘤患者仍存在預(yù)后較差的現(xiàn)象［2］。目前對(duì)骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制尚未有明確定論，不少學(xué)者認(rèn)為某些癌基因，如多藥耐藥基因（MDR1）［3］、白細(xì)胞分化抗原 269（CD269）［4］、N?RAS［5］、MT1［6］等的表達(dá)與骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其中MDR1的表達(dá)產(chǎn)物P?gp蛋白可將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的藥物泵出細(xì)胞外，削弱藥物治療效果，是人體重要的耐藥基因［7］。CD269基因則在維持漿細(xì)胞活性中起關(guān)鍵作用，且其調(diào)控的JNK信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增值與存活［8］。目前有關(guān)MDR1基因與CD269基因表達(dá)與老年骨髓瘤臨床病理特征及疾病預(yù)后間關(guān)系的報(bào)道較少，為進(jìn)一步探討兩基因在骨髓瘤病情進(jìn)展過(guò)程中機(jī)制，本研究通過(guò)采用定量PCR法檢測(cè)了骨髓瘤患者體內(nèi)MDR1基因與CD269基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)兩基因與骨髓瘤臨床病理表現(xiàn)及患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討。具體報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象以2012年1月至2013年6月高郵市人民醫(yī)院收治的老年骨髓瘤患者為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）經(jīng)常規(guī)檢查、骨髓細(xì)胞學(xué)檢查、骨ECT、骨髓像分析等確診為骨髓瘤；（2）首發(fā)患者；（3）年齡超過(guò)65歲。最終符合標(biāo)準(zhǔn)的患者34例，其中男20例，女14例，患者平均年齡（71.6±4.6）歲。按照骨髓瘤的DS分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期12例，Ⅲ期11例。此外，選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的健康者30例為對(duì)照組，其中男18例，女12例，患者平均年齡（72.1±3.9）歲。骨髓瘤組與對(duì)照組性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有程序均經(jīng)筆者所在醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員審核、批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑儀器：LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche公司，96通量）；臺(tái)式高速度冷凍離心機(jī)（德國(guó)ELRCRON公司）；自動(dòng)生化分析儀 LX?21（美國(guó) BECKMAN公司）；酶標(biāo)儀（BMG，LABTECH POLARstar Omega）；37°C恒溫培養(yǎng)箱（上海天呈科技有限公司）。

試劑：RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上?；鶢栴D生物科技有限公司），CD269和MDR1引物（美國(guó) Santa Cruz公司），Trizol試劑（invitrogen公司），多聚賴氨酸（Sigma公司），二氨基聯(lián)苯胺顯色劑（南京化學(xué)試劑有限公司）。

1.3方法

1.3.1MDR1基因檢測(cè)分別采集兩組約3 mL外周血，并將紅細(xì)胞裂解液加入離心管后震動(dòng)1 min，8 000 r/min離心1 min后棄去上清液，搜集管底白色沉淀物。加入核裂解液，搖勻、65℃下反應(yīng)1～2 h，待沉淀物完全溶解后加入蛋白清除液，0～5℃冰浴下反應(yīng)10 min，隨后12 000 r/min離心10 min，上清加入90%乙醇溶液。使用Trizol試劑（Invitrogen公司生產(chǎn)）提取總RNA，利用Primer ex?press 2.0軟件設(shè)計(jì)引物與探針，隨后將提取的RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Light?Cycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)對(duì)各樣本進(jìn)行分析，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定具體條件為：42℃條件下反應(yīng)30 min，反轉(zhuǎn)錄后95℃預(yù)變性3 min，同溫度下95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，最終經(jīng)歷30個(gè)循環(huán)。記錄MDR1的mRNA拷貝數(shù)。

MDR1特異性引物及探針序列

MDR1F：5′?CAGAATCCTCCTGCTGGAGTA?3′

MDR1R：5′?GAACCACTGCCTTGCTTTCTG?3′

MDR1P：5′?ACGCTAGCCTTGGAC?3′

（探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記不發(fā)光的基團(tuán)MGB。產(chǎn)物長(zhǎng)度為61 bp）

1.3.2CD269基因檢測(cè)分別采集兩組約100 μL骨髓液，并將300 μL Trizol及500 μL氯仿加入離心管后震動(dòng)1 min，放置5 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入100 μL異丙醇，搖勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心10 min后搜集底部沉淀。加入100 μL乙醇，搖勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min后搜集底部沉淀，風(fēng)干5 min，加入50 μL DEPC水解待用。將提取的RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)對(duì)各樣本進(jìn)行分析，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定具體條件為：94℃變性4 min，94℃反應(yīng)15 s，60℃退火 40 s，72℃延伸30 s，最終經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)。

CD269特異性引物及探針序列

CD269F：5′?ATGCAGCTGGCTTCA?3′

CD269R：5′?TTCGTGAGTAAGGGG?3′

CD269P：5′?TTGTGTCTGACTTACCA?3′

1.3.3隨訪隨訪時(shí)間從入院開(kāi)始至最后一次隨訪或患者死亡的間隔時(shí)間。本研究隨訪時(shí)間為11～60個(gè)月，其中失訪病例1例，局部復(fù)發(fā)3例，死亡5例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。采用Pearson相關(guān)性分析分析老年骨髓瘤患者中MDR1基因及CD269基因的表達(dá)與臨床病理特征及疾病預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同組MDR1基因與CD269基因的表達(dá)MDR1基因與CD269基因在骨髓瘤組表達(dá)高于對(duì)照組，且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2MDR1基因、CD269基因的表達(dá)與疾病臨床數(shù)據(jù)關(guān)系考察不同臨床病理特征的MDR1基因與CD269基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示MDR1基因與CD269基因表達(dá)在性別、年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在生存時(shí)間、分期、復(fù)發(fā)以及CCI評(píng)分方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著MDR1基因與CD269基因表達(dá)量升高的患者復(fù)發(fā)比例越高，且生存時(shí)間越短，CCI評(píng)分越高。見(jiàn)表2。

表1 不同組MDR1基因與CD269基因的表達(dá)情況Tab.1 The expression of MDR1 and CD269 in different groups ±s

表1 不同組MDR1基因與CD269基因的表達(dá)情況Tab.1 The expression of MDR1 and CD269 in different groups ±s

組別骨髓瘤組對(duì)照組t值P值例數(shù)34 30 MDR1基因12.24±1.07 0.44±0.13 63.770＜0.001 CD269基因4.51±1.22 0.59±0.11 18.650＜0.001

2.3 MDR1基因、CD269基因的表達(dá)與CCI評(píng)分的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析表明，MDR1基因表達(dá)與CCI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.786，P＜0.001），CD269基因表達(dá)與CCI評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r=0.825，P＜0.001），MDR1基因表達(dá)與CD269基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.779，P＜0.001）。

表2 MDR1基因、CD269基因表達(dá)與疾病臨床數(shù)據(jù)關(guān)系Tab.2 Relationship between MDR1 and CD269 gene expression and cliniical data of disease ±s

表2 MDR1基因、CD269基因表達(dá)與疾病臨床數(shù)據(jù)關(guān)系Tab.2 Relationship between MDR1 and CD269 gene expression and cliniical data of disease ±s

臨床病理參數(shù)年齡（歲）＜70≥70性別男 女分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期復(fù)發(fā)否 是生存時(shí)間（月）＜60≥60 CCI評(píng)分＜5≥5例數(shù)20 14 20 14 11 12 11 3011.99±3 18.77±517.12±2812.06±26 7 MDR1基因12.09±1.44 12.36±1.32 12.27±0.98 12.19±1.21 7.24±0.65 12.05±1.17 18.56±3.41 1.09 2.65 3.44 1.33 11.79±1.21 16.24±2.12 t/F值0.556 0.213 6.312 4.394 3.246 5.325 P值0.582 0.833＜0.001 0.048 0.031 0.001 CD269基因4.24±1.06 4.66±1.49 4.46±1.01 4.59±1.53 1.98±0.43 4.24±0.87 6.87±1.33 4.39±0.98 8.77±1.27 6.67±1.43 4.24±0.95 4.02±0.98 6.74±1.17 t/F值0.962 0.299 6.517 7.224 3.633 6.265 P值0.343 0.767＜0.001 0.000 0.001＜0.001

3 討論

隨著社會(huì)人口老齡化，老年骨髓瘤患者的發(fā)病率逐年升高。目前臨床上缺乏業(yè)界公認(rèn)的預(yù)后評(píng)價(jià)手段。由于老年患者治療不良反應(yīng)大，或合并癥廣泛存在，藥物劑量不足等，使其預(yù)后效果遜色于其他人群［9］。既往研究［10］顯示，Charlson指數(shù)（CCI）能夠有效預(yù)測(cè)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，可有效評(píng)估老年腫瘤患者并發(fā)癥危險(xiǎn)程度。本研究中考察了老年骨髓瘤患者與健康者體內(nèi)MDR1基因及CD269基因表達(dá)的差異，試圖研究?jī)苫蚺c疾病預(yù)后的關(guān)系，構(gòu)建預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)與患者生物學(xué)表現(xiàn)間的聯(lián)系。

CD269基因?qū)儆谀[瘤壞死因子受體（TNFR）家族，具有維持漿細(xì)胞活性，活化骨髓瘤細(xì)胞增殖等作用。據(jù)報(bào)道［11］，敲除CD269基因的小鼠，其體內(nèi)漿細(xì)胞數(shù)量顯著降低，但B細(xì)胞發(fā)育正常，且T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)與T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)未出現(xiàn)明顯異常。此外，CD269通過(guò)調(diào)節(jié)JN K通路，促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖與存活［12］。本研究中，骨髓瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD269基因表達(dá)顯著高于健康受試者，提示CD269基因的表達(dá)與骨髓瘤的發(fā)生具有相關(guān)性，這一結(jié)論與劉玉霞等［13］報(bào)道一致。比較不同臨床病理特征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD269基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，年齡、性別不同的患者CD269基因的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、CCI評(píng)分＜5以及60個(gè)月內(nèi)死亡的患者CD269基因的表達(dá)明顯高于未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、CCI評(píng)分≥5、生存時(shí)間長(zhǎng)于60個(gè)月的患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且CD269基因表達(dá)與CCI評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）。提示CD269基因的表達(dá)與患者預(yù)后不良存在明確相關(guān)性。

據(jù)報(bào)道［14］，MDR1基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠影響細(xì)胞免疫能力，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞排斥進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤性藥物提高細(xì)胞對(duì)抗癌藥的耐受性。研究中發(fā)現(xiàn)骨髓瘤患者體內(nèi)MDR1基因表達(dá)明顯高于健康者，這可能由于當(dāng)出現(xiàn)骨髓瘤病變時(shí)，腫瘤毒性物質(zhì)激活MDR1基因表達(dá)［15］。此外，本研究中定量PCR結(jié)果顯示，不同年齡、性別的患者，骨髓液中MDR1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但腫瘤復(fù)發(fā)、CCI評(píng)分＜5以及生存時(shí)間短的患者骨髓液中MDR1的表達(dá)較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，MDR1基因表達(dá)與CD269基因表達(dá)呈正相關(guān)，但兩者呈相關(guān)性的具體機(jī)制仍待研究。

綜上所述，MDR1基因、CD269基因在老年骨髓瘤患者中的表達(dá)明顯高于健康者，且與患者預(yù)后存在顯著相關(guān)性。