姜方毅 陳桂明 瞿玉興 夏圣

1江蘇大學醫(yī)學院免疫學與免疫檢驗教研室/醫(yī)學檢驗研究所（江蘇鎮(zhèn)江 212013）；2高郵市人民醫(yī)院檢驗科（江蘇高郵 225600）；3常州市中醫(yī)院骨科（江蘇常州 213000）

骨髓瘤是一種骨髓中出現單克隆漿細胞大量增多的惡性血液疾病，以骨痛、腎功能不全、貧血、高鈣血等癥狀為特征，發(fā)病率約為血液系統(tǒng)腫瘤的十分之一［1］。近年來，隨著不少免疫調節(jié)藥物及蛋白酶抑制劑的問世，骨髓瘤患者預后得到明顯改善，但老年骨髓瘤患者仍存在預后較差的現象［2］。目前對骨髓瘤的發(fā)病機制尚未有明確定論，不少學者認為某些癌基因，如多藥耐藥基因（MDR1）［3］、白細胞分化抗原 269（CD269）［4］、N?RAS［5］、MT1［6］等的表達與骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。其中MDR1的表達產物P?gp蛋白可將進入腫瘤細胞的藥物泵出細胞外，削弱藥物治療效果，是人體重要的耐藥基因［7］。CD269基因則在維持漿細胞活性中起關鍵作用，且其調控的JNK信號通路能夠促進骨髓瘤細胞的增值與存活［8］。目前有關MDR1基因與CD269基因表達與老年骨髓瘤臨床病理特征及疾病預后間關系的報道較少，為進一步探討兩基因在骨髓瘤病情進展過程中機制，本研究通過采用定量PCR法檢測了骨髓瘤患者體內MDR1基因與CD269基因的表達，同時對兩基因與骨髓瘤臨床病理表現及患者預后的關系進行探討。具體報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象以2012年1月至2013年6月高郵市人民醫(yī)院收治的老年骨髓瘤患者為研究對象。入選標準為：（1）經常規(guī)檢查、骨髓細胞學檢查、骨ECT、骨髓像分析等確診為骨髓瘤；（2）首發(fā)患者；（3）年齡超過65歲。最終符合標準的患者34例，其中男20例，女14例，患者平均年齡（71.6±4.6）歲。按照骨髓瘤的DS分期標準進行分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期12例，Ⅲ期11例。此外，選取同期在我院進行健康體檢的健康者30例為對照組，其中男18例，女12例，患者平均年齡（72.1±3.9）歲。骨髓瘤組與對照組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有程序均經筆者所在醫(yī)院的醫(yī)學倫理委員審核、批準。

1.2儀器與試劑儀器：LightCycler?96全自動熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche公司，96通量）；臺式高速度冷凍離心機（德國ELRCRON公司）；自動生化分析儀 LX?21（美國 BECKMAN公司）；酶標儀（BMG，LABTECH POLARstar Omega）；37°C恒溫培養(yǎng)箱（上海天呈科技有限公司）。

試劑：RNA逆轉錄試劑盒（上海基爾頓生物科技有限公司），CD269和MDR1引物（美國 Santa Cruz公司），Trizol試劑（invitrogen公司），多聚賴氨酸（Sigma公司），二氨基聯苯胺顯色劑（南京化學試劑有限公司）。

1.3方法

1.3.1MDR1基因檢測分別采集兩組約3 mL外周血，并將紅細胞裂解液加入離心管后震動1 min，8 000 r/min離心1 min后棄去上清液，搜集管底白色沉淀物。加入核裂解液，搖勻、65℃下反應1～2 h，待沉淀物完全溶解后加入蛋白清除液，0～5℃冰浴下反應10 min，隨后12 000 r/min離心10 min，上清加入90%乙醇溶液。使用Trizol試劑（Invitrogen公司生產）提取總RNA，利用Primer ex?press 2.0軟件設計引物與探針，隨后將提取的RNA在20 μL反應體系中逆轉錄為cDNA。采用Light?Cycler?96全自動熒光定量PCR系統(tǒng)對各樣本進行分析，每個樣本重復測定3次，測定具體條件為：42℃條件下反應30 min，反轉錄后95℃預變性3 min，同溫度下95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，最終經歷30個循環(huán)。記錄MDR1的mRNA拷貝數。

MDR1特異性引物及探針序列

MDR1F：5′?CAGAATCCTCCTGCTGGAGTA?3′

MDR1R：5′?GAACCACTGCCTTGCTTTCTG?3′

MDR1P：5′?ACGCTAGCCTTGGAC?3′

（探針5′端標記熒光報告基團FAM，3′端標記不發(fā)光的基團MGB。產物長度為61 bp）

1.3.2CD269基因檢測分別采集兩組約100 μL骨髓液，并將300 μL Trizol及500 μL氯仿加入離心管后震動1 min，放置5 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液轉移至新的離心管中。加入100 μL異丙醇，搖勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心10 min后搜集底部沉淀。加入100 μL乙醇，搖勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min后搜集底部沉淀，風干5 min，加入50 μL DEPC水解待用。將提取的RNA在20 μL反應體系中逆轉錄為cDNA。采用LightCycler?96全自動熒光定量PCR系統(tǒng)對各樣本進行分析，每個樣本重復測定3次，測定具體條件為：94℃變性4 min，94℃反應15 s，60℃退火 40 s，72℃延伸30 s，最終經歷40個循環(huán)。

CD269特異性引物及探針序列

CD269F：5′?ATGCAGCTGGCTTCA?3′

CD269R：5′?TTCGTGAGTAAGGGG?3′

CD269P：5′?TTGTGTCTGACTTACCA?3′

1.3.3隨訪隨訪時間從入院開始至最后一次隨訪或患者死亡的間隔時間。本研究隨訪時間為11～60個月，其中失訪病例1例，局部復發(fā)3例，死亡5例。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量數據采用均值±標準差表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析。采用Pearson相關性分析分析老年骨髓瘤患者中MDR1基因及CD269基因的表達與臨床病理特征及疾病預后的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同組MDR1基因與CD269基因的表達MDR1基因與CD269基因在骨髓瘤組表達高于對照組，且組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2MDR1基因、CD269基因的表達與疾病臨床數據關系考察不同臨床病理特征的MDR1基因與CD269基因表達情況，結果顯示MDR1基因與CD269基因表達在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在生存時間、分期、復發(fā)以及CCI評分方面差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著MDR1基因與CD269基因表達量升高的患者復發(fā)比例越高，且生存時間越短，CCI評分越高。見表2。

表1 不同組MDR1基因與CD269基因的表達情況Tab.1 The expression of MDR1 and CD269 in different groups ±s

表1 不同組MDR1基因與CD269基因的表達情況Tab.1 The expression of MDR1 and CD269 in different groups ±s

組別骨髓瘤組對照組t值P值例數34 30 MDR1基因12.24±1.07 0.44±0.13 63.770＜0.001 CD269基因4.51±1.22 0.59±0.11 18.650＜0.001

2.3 MDR1基因、CD269基因的表達與CCI評分的相關性分析Pearson相關性分析表明，MDR1基因表達與CCI評分呈正相關（r=0.786，P＜0.001），CD269基因表達與CCI評分呈顯著正相關（r=0.825，P＜0.001），MDR1基因表達與CD269基因表達呈顯著正相關（r=0.779，P＜0.001）。

表2 MDR1基因、CD269基因表達與疾病臨床數據關系Tab.2 Relationship between MDR1 and CD269 gene expression and cliniical data of disease ±s

表2 MDR1基因、CD269基因表達與疾病臨床數據關系Tab.2 Relationship between MDR1 and CD269 gene expression and cliniical data of disease ±s

臨床病理參數年齡（歲）＜70≥70性別男 女分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期復發(fā)否 是生存時間（月）＜60≥60 CCI評分＜5≥5例數20 14 20 14 11 12 11 3011.99±3 18.77±517.12±2812.06±26 7 MDR1基因12.09±1.44 12.36±1.32 12.27±0.98 12.19±1.21 7.24±0.65 12.05±1.17 18.56±3.41 1.09 2.65 3.44 1.33 11.79±1.21 16.24±2.12 t/F值0.556 0.213 6.312 4.394 3.246 5.325 P值0.582 0.833＜0.001 0.048 0.031 0.001 CD269基因4.24±1.06 4.66±1.49 4.46±1.01 4.59±1.53 1.98±0.43 4.24±0.87 6.87±1.33 4.39±0.98 8.77±1.27 6.67±1.43 4.24±0.95 4.02±0.98 6.74±1.17 t/F值0.962 0.299 6.517 7.224 3.633 6.265 P值0.343 0.767＜0.001 0.000 0.001＜0.001

3 討論

隨著社會人口老齡化，老年骨髓瘤患者的發(fā)病率逐年升高。目前臨床上缺乏業(yè)界公認的預后評價手段。由于老年患者治療不良反應大，或合并癥廣泛存在，藥物劑量不足等，使其預后效果遜色于其他人群［9］。既往研究［10］顯示，Charlson指數（CCI）能夠有效預測患者死亡風險，可有效評估老年腫瘤患者并發(fā)癥危險程度。本研究中考察了老年骨髓瘤患者與健康者體內MDR1基因及CD269基因表達的差異，試圖研究兩基因與疾病預后的關系，構建預后評價指標與患者生物學表現間的聯系。

CD269基因屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族，具有維持漿細胞活性，活化骨髓瘤細胞增殖等作用。據報道［11］，敲除CD269基因的小鼠，其體內漿細胞數量顯著降低，但B細胞發(fā)育正常，且T細胞依賴性免疫反應與T細胞非依賴性免疫反應未出現明顯異常。此外，CD269通過調節(jié)JN K通路，促進骨髓瘤細胞增殖與存活［12］。本研究中，骨髓瘤患者的外周血單個核細胞中CD269基因表達顯著高于健康受試者，提示CD269基因的表達與骨髓瘤的發(fā)生具有相關性，這一結論與劉玉霞等［13］報道一致。比較不同臨床病理特征患者外周血單個核細胞中CD269基因的表達發(fā)現，年齡、性別不同的患者CD269基因的表達差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而出現腫瘤復發(fā)、CCI評分＜5以及60個月內死亡的患者CD269基因的表達明顯高于未出現腫瘤復發(fā)、CCI評分≥5、生存時間長于60個月的患者，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且CD269基因表達與CCI評分呈正相關（P＜0.05）。提示CD269基因的表達與患者預后不良存在明確相關性。

據報道［14］，MDR1基因的表達產物能夠影響細胞免疫能力，通過誘導細胞排斥進入細胞內的抗腫瘤性藥物提高細胞對抗癌藥的耐受性。研究中發(fā)現骨髓瘤患者體內MDR1基因表達明顯高于健康者，這可能由于當出現骨髓瘤病變時，腫瘤毒性物質激活MDR1基因表達［15］。此外，本研究中定量PCR結果顯示，不同年齡、性別的患者，骨髓液中MDR1的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但腫瘤復發(fā)、CCI評分＜5以及生存時間短的患者骨髓液中MDR1的表達較高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，MDR1基因表達與CD269基因表達呈正相關，但兩者呈相關性的具體機制仍待研究。

綜上所述，MDR1基因、CD269基因在老年骨髓瘤患者中的表達明顯高于健康者，且與患者預后存在顯著相關性。