劉展 唐艷 李云濤 李世紅 劉雁軍 龐宇 古建輝 成檸

成都市第三人民醫(yī)院1普外科，2病理科，3信息管理部（成都 610031）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，一度占據(jù)各類惡性腫瘤榜首。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胃癌的危險因素包括環(huán)境、遺傳兩方面，二者相互作用，在多基因參與調(diào)控下經(jīng)多階段使胃組織發(fā)生惡變，進展為腫瘤［1-2］。關(guān)于胃癌的治療除常規(guī)手術(shù)、化療外，靶向藥物及免疫治療等均有實質(zhì)性進展，但效果仍不達預(yù)期。細究原因，不難發(fā)現(xiàn)，腫瘤無限增殖及惡性侵襲是阻礙療效發(fā)揮的重要因素。目前，國內(nèi)外探究胃癌增值侵襲機制的報道不在少數(shù)，然而此過程中相關(guān)信號通路較為復(fù)雜，所涉及的調(diào)控基因可達數(shù)百，擴展研究極有必要［3］。KAZEMI等［4］發(fā)現(xiàn)血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）與肺癌遠處轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，其研究結(jié)果顯示與正常肺組織與淋巴結(jié)相比，ANGPTL2在肺癌組織以及轉(zhuǎn)移的肺組織中呈現(xiàn)較高表達。此外，多名研究學(xué)者揭示ANGPTL2與食管鱗癌、乳腺癌惡化進程存在某種聯(lián)系［5-6］。盡管ANGPTL2與多種惡性腫瘤增值轉(zhuǎn)移相關(guān)，但關(guān)于其在胃癌中表達水平以及增殖與侵襲能力的研究甚少，需進一步深入研究。因此，本研究欲通過蛋白印記、MTT以及TRANSWELL等實驗方法分析胃癌與正常胃組織中ANGPTL2的表達水平差異以及其在胃癌細胞增殖與侵襲中的作用，為臨床治療胃癌提供新的靶點。

1 對象與方法

1.1研究對象本研究選擇2015年12月至2017年12月于我院就診住院的60例患者，所選患者均經(jīng)病理檢查確診為胃腺癌，患者年齡范圍為25～80歲，平均（48.9±10.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者為首次就診，就診前未經(jīng)過相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者存在消化道疾病；（2）合并其他腫瘤。采集入組患者癌組織及正常的癌旁組織分別作為此次研究的實驗組與對照組。采集入組患者的癌組織及癌旁正常組織作為實驗標(biāo)本，本研究經(jīng)患者及家屬知情且同意，并通過我院倫理委員會審查。

1.2方法

1.2.1試驗材料及儀器本次研究所用的正常胃黏膜上皮細胞株（GES?1）、高分化胃癌細胞株（N87）、中分化胃癌細胞株（SGC7901）、低分化胃癌細胞株（BGC823）、低分化胃腺癌細胞株（PAMC82）均由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司產(chǎn)品；抗人ANGPTL2單克隆抗體（規(guī)格：100 μL）及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗由北京博邁斯科技發(fā)展有限公司提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒（WB101）、RIPA細胞裂解液購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；Transwell小室（貨號#3397）來源于美國CoringCostar公司。慢病毒包裝系統(tǒng)（含GFP）由賽業(yè)生物科技有限公司輔助構(gòu)建，LipofectamineTM2000則來自美國Invitrogen公司。儀器包括蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（美國Bio?Rad公司）、Eppendor高速離心機（北京伯輝生物科技有限公司）、奧林巴斯倒置IX83倒置熒光顯微鏡（北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司）等。

1.2.2蛋白免疫印記試驗用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取胃癌細胞株總蛋白，采用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，配制10%SDS?聚丙烯酰胺凝膠，取60 μg樣本，置于足量的電泳液中，根據(jù)測得的蛋白濃度上樣，用50 V電壓開始電泳，樣品進入分離膠將電壓調(diào)至100 V。電泳結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，棄去封閉液，孵稀釋的一抗（1∶1 000），4℃過夜，棄去一抗，PBST洗膜；與HRP標(biāo)記的IgG二抗于室溫下共孵育1 h，棄去二抗，PBST洗膜，DAB顯影，分析數(shù)據(jù)，以目的基因條帶及β?actin條帶灰度值比值表示檢測因子水平。

1.2.3慢病毒感染收集PAMC82胃癌細胞株，先按照2 mL/孔，細胞懸液密度為1×105/mL的標(biāo)準(zhǔn)接種6孔板，24 h后在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下對其進行慢病毒感染，分為ANGPTL2過表達組（Lv?ANGPTL2）、ANGPTL2沉默組（ANGPTL2?shR?NA）以及對照組（NC?shRNA），最后進行篩選，除去所有未感染病毒的細胞。

1.2.4MTT實驗分析細胞增殖能力將PAMC82胃癌細胞株以每孔5×103個接種至96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔，共接種4塊96孔板，于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，以含等體積的DMSO和無血清無抗生素的培養(yǎng)基為對照組。分別于培養(yǎng)后24、48、72、96 h后，向每孔細胞中加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，輕蕩10 min以溶解藍色結(jié)晶，于酶標(biāo)儀570 nm處測量各孔光密度值（OD），計算細胞增殖率。

1.2.5Transwell小室實驗將PAMC82胃癌細胞株分為Lv?ANGPTL2、ANGPTL2?shRNA以及Lv?NC三組。將300 μL密度為1×106/mL的細胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后，檢測OD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)性變量（正態(tài)分布）采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ANGPTL2的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系蛋白印記結(jié)果顯示，ANGPTL2在癌旁組織中的灰度值為（0.641±0.130），在胃癌組織中為（0.062±0.007），兩組相比，胃癌組織中ANGPTL2的表達更高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（t=34.449，P＜0.001）。進一步分析發(fā)現(xiàn)ANGPTL2的表達水平與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及T分期相關(guān)。腫瘤分化程度越低、分期越高、存在淋巴轉(zhuǎn)移者，ANGPTL2的表達水平越高。見表1。

表1 ANGPTL2的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The association of ANGPTL2 expression with pathological features ±s

表1 ANGPTL2的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The association of ANGPTL2 expression with pathological features ±s

項目腫瘤分化情況高-中分化低分化T分期T1+T2 T3+T4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無例數(shù)16 44 24 36 32 28 ANGPTL2的灰度值0.569±0.204 0.842±0.217 0.405±0.191 0.796±0.270 0.663±0.204 0.410±0.155 t值4.376 6.137 5.347 P值0.000 0.000 0.000

2.2 Western Blot分析ANGPTL2的蛋白水平通過Western Blot進一步分析正常胃黏膜上皮細胞株GES?1與N87、SGC7901、BGC823、PAMC82四類細胞株中ANGPTL2蛋白表達含量的差異。如圖1所示，N87、SGC7901、BGC823、PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2的蛋白水平均高于GES?1（P＜0.05），上述四類胃癌細胞中的ANGPTL2蛋白含量分別是GES?1的1.1、1.3、1.8及2.1倍。內(nèi)參蛋白β?actin的表達情況在各組中均無明顯變化，見圖2。

圖1 ANGPTL2在各胃細胞中的蛋白表達情況Fig.1 The protein expression of ANGPTL2 in gastric cell lines

圖2 各類細胞株ANGPTL2蛋白含量檢測結(jié)果Fig.2 The results of ANGPTL2 protein level in each cell lines

2.3 檢測各類胃癌細胞株中過表達與敲低ANG?PTL2的情況本文構(gòu)建了Lv?ANGPTL2與Lv?NC、ANGPTL2?shRNA與NC?shRNA四種載體，分別感染PAMC82胃癌細胞株。收集以上幾組細胞以及兩組空白對照細胞的蛋白質(zhì)，經(jīng)western blot分析發(fā)現(xiàn)，在感染了Lv?ANGPTL2的PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2的蛋白水平均高于感染Lv?NC以及空白對照組的細胞；感染ANGPTL2?shRNA的PAMC82胃癌細胞株低于感染NC?shRNA及對照組的細胞株，見表2、3。

表2 空白對照組、Lv?NC以及Lv?ANGPTL2 3組在PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2蛋白灰度值分析Tab.2 The comparison of the gray value of ANGPTL2 protein in blank control，Lv?NC and Lv?ANGPTL2 PAMC82 gastric cancer cells ±s

表2 空白對照組、Lv?NC以及Lv?ANGPTL2 3組在PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2蛋白灰度值分析Tab.2 The comparison of the gray value of ANGPTL2 protein in blank control，Lv?NC and Lv?ANGPTL2 PAMC82 gastric cancer cells ±s

注：與空白對照及Lv?NC組相比，*P＜0.05

組別空白對照Lv?NC Lv?ANGPTL2 0.58±0.03 0.56±0.02 0.92±0.03*ANGPTL2/β?actin

表3 空白對照組、NC?shRNA以及ANGPTL2?shRNA 3組在PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2蛋白灰度值分析Tab.3 The comparison of the gray value of ANGPTL2 protein in blank control，NC?shRNA and ANGPTL2?shRNA PAMC82 gastric cancer cells ±s

表3 空白對照組、NC?shRNA以及ANGPTL2?shRNA 3組在PAMC82胃癌細胞株中ANGPTL2蛋白灰度值分析Tab.3 The comparison of the gray value of ANGPTL2 protein in blank control，NC?shRNA and ANGPTL2?shRNA PAMC82 gastric cancer cells ±s

注：與空白對照及NC?shRNA組相比，*P＜0.05

組別空白對照NC?shRNA ANGPTL2?shRNA ANGPTL2/β?actin 0.63±0.02 0.65±0.02 0.44±0.01*

2.4 ANGPTL2對胃癌細胞增殖能力的影響MTT實驗檢測過表達/沉默ANGPTL2對PAMC82胃癌細胞株增殖能力的影響。結(jié)果顯示，各類細胞增殖能力隨時間變化均呈上升趨勢，Lv?NC組與空白對照組以及NC?shRNA組與空白對照組的增長趨勢無統(tǒng)計學(xué)差異；24 h時，方差分析顯示各類細胞株細胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.932，P=1.654）。而在48、72及96 h時，Lv?ANGPTL2的增殖能力高于Lv?NC組、空白對照組；ANGPTL2?shRNA增殖能力低于NC?shRNA、空白對照組。見圖3、4。

2.5 ANGPTL2提高了胃癌細胞株的侵襲能力采用Transwell小室實驗檢測ANGPTL2在PAMC82胃癌細胞株侵襲中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lv?ANGPTL2組的侵襲能力明顯高于Lv?NC組與空白對照組，ANGPTL2?shRNA組的侵襲能力明顯低于NC?shR?NA組與空白對照組。見表4、5。

圖3 過表達ANGPTL2提高胃癌細胞的增殖能力Fig.3 The stable overexpression of ANGPTL2 contributed to the proliferation of gastric cancer cells

圖4 沉默ANGPTL2降低胃癌細胞的增殖能力Fig.4 The knockdown ANGPTL2 weakened the proliferation of gastric cancer cells

表4 過表達ANGPTL2提高PAMC82胃癌細胞株的侵襲能力Tab.4 The stable overexpression of ANGPTL2 contributed to the invasive ability of PAMC82 gastric cancer cells ±s

表4 過表達ANGPTL2提高PAMC82胃癌細胞株的侵襲能力Tab.4 The stable overexpression of ANGPTL2 contributed to the invasive ability of PAMC82 gastric cancer cells ±s

注：與空白對照及Lv?NC組相比，**P＜0.01

組別空白對照Lv?NC Lv?ANGPTL2 OD值0.279±0.020 0.281±0.019 0.451±0.008**

表5 敲減ANGPTL2降低PAMC82胃癌細胞株的侵襲能力Tab.5 The knockdown ANGPTL2 weakened the invasive ability of PAMC82 gastric cancer cells ±s

表5 敲減ANGPTL2降低PAMC82胃癌細胞株的侵襲能力Tab.5 The knockdown ANGPTL2 weakened the invasive ability of PAMC82 gastric cancer cells ±s

注：與空白對照及NC?shRNA組相比，**P＜0.01

組別空白對照NC?shRNA ANGPTL2?shRNA OD值0.301±0.021 0.299±0.013 0.156±0.018**

3 討論

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，胃癌的發(fā)病率也隨之增高，病死率較高。幽門螺桿菌感染、胃息肉、胃炎等多種因素都可導(dǎo)致胃癌的發(fā)?。?］。近年來，YUGAMI等［8］發(fā)現(xiàn)一種新的分泌型糖蛋白-ANGPTL，其在成人的心臟、腸、以及脂肪組織中呈高表達。該蛋白擁有與血管生成素蛋白（angiopoietin，Ang）相似的功能，可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能的發(fā)揮、血管內(nèi)皮細胞的遷移與血管生成［9］。有研究表明ANGPTL2過表達的小鼠脂肪組織的血管可發(fā)生炎癥以及巨噬細胞的浸潤，并且脂肪組織中的 IL?6、IL?1以及 TNF 等炎癥因子的表達也明顯高于野生型小鼠［10］。盡管目前對ANGPTL2已經(jīng)有了一定的了解，但其在胃癌中的表達水平以及對胃癌細胞增殖與侵襲能力的影響尚不清楚。因此，本研究探究了胃癌細胞株與正常胃細胞中ANGPTL2的表達水平是否存在差異以及其在胃癌細胞增殖與侵襲中所發(fā)揮的作用，為更好的治療胃癌提供新的靶點。

本次的研究結(jié)果顯示，與正常胃組織相比，胃癌組織中ANGPTL2蛋白的含量顯著升高，并且ANGPTL2與腫瘤的分化情況、T分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，分化程度低的胃癌細胞中ANGPTL2蛋白表達水平更高，T3+T4期的胃癌中ANGPTL2蛋白表達高于T1+T2期的胃癌，存在淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌中的ANGPTL2蛋白表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，這提示ANGPTL2與胃癌的發(fā)生緊密相關(guān)。有研究表明，肺癌手術(shù)后的生存期與肺癌組織中ANGPTL2的表達量呈負相關(guān)，肺癌細胞中表達的ANGPTL2可以通過自分泌與旁分泌的形式加快肺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［11-12］。胃癌中高表達的ANGPTL2可能與其在肺癌中發(fā)揮的作用相似，可以加快胃癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，加快胃癌的發(fā)生與發(fā)展。此外，Western blot結(jié)果顯示各類胃癌細胞株中的ANGPTL2表達顯著高于正常胃黏膜上皮細胞株GES?1，且ANGPTL2蛋白表達水平于胃癌細胞株BGC823與PAMC82中相對較高，是GES?1的1.8與2.1倍。N87、SGC7901細胞株ANGPTL2蛋白表達水平雖高于GES?1，但低于BGC823、PAMC82，這可能是因為N87與SGC7901來自轉(zhuǎn)移能力較低的細胞系的緣故；而BGC823與PAMC82來自惡性程度較高的細胞系，且其遷移能力強于N87與SGC7901。有文獻報道，PAMC82細胞的致瘤能力高于N87細胞［13］。此次研究結(jié)果亦提示ANGPTL2在惡性程度高的胃癌細胞株中的表達更高。

本研究采用PAMC82細胞，該細胞屬于低分化胃腺癌細胞株，惡性程度高在胃癌的增殖與侵襲研究中有一定的優(yōu)勢。由于慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，本研究采用慢病毒感染的方法進行干擾與過表達ANGPTL2。經(jīng)Western blot證實ANGPTL2的干擾和過表達結(jié)果良好，可以用于后續(xù)研究。

MTT與Transwell小室實驗結(jié)果表明過表達ANGPTL2顯著加快了胃癌細胞株P(guān)AMC82的增殖與侵襲速度，干擾ANGPTL2表達則明顯阻礙了胃癌細胞株P(guān)AMC82的增殖與侵襲。此次研究結(jié)果表明ANGPTL2有助于胃癌細胞株的增殖與遷移。HORIGUCHI等［14］證實ANGPTL2通過干預(yù)癌細胞內(nèi)信號通路抑制細胞凋亡，加快細胞生長并促進其侵襲。還有研究表明，ANGPTL2可以增強Rec?1/NF?κB途徑的活性，促進血管生成，并且還可以和某些整合素結(jié)合，有助于THP?1細胞的遷移，而整合素在腫瘤的增殖與侵襲中發(fā)揮了重要作用［15］。推測ANGPTL2可能是通過與整合素結(jié)合減少細胞凋亡，促進某些物質(zhì)的表達并激活相應(yīng)信號通路，來加快胃癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。由上可知，抑制ANGPTL2的表達可在一定程度上緩解胃癌細胞惡性增殖與轉(zhuǎn)移的能力，聯(lián)合臨床治療或能改善患者預(yù)后，延長生存時間。

本研究的不足之處在于數(shù)據(jù)量較小，臨床分析還不夠充分。筆者將在下一步的研究中進一步擴大樣本量，深入分析ANGPTL2與胃癌發(fā)生的關(guān)系，為臨床胃癌治療、預(yù)后恢復(fù)提供論證。

總之，與癌旁正常組織相比，ANGPTL2在胃癌組織的蛋白表達水平更高。胃癌細胞株中ANG?PTL2在蛋白水平的表達顯著高于正常胃粘膜細胞株，且惡性程度越高的胃癌組織與細胞株ANG?PTL2的表達水平越高。其次，ANGPTL2有助于胃癌細胞株的增殖與遷移，ANGPTL2可能成為人類治療胃癌新的靶點。