武薇 曾惠昆 張敏 張琳

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室（廣州 510515）

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個在時空上均受修復(fù)因子調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程，多種生物活性物質(zhì)在創(chuàng)傷愈合的不同階段發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1］。其中組織修復(fù)階段形成的肉芽組織在皮膚傷口愈合過程中具有重要的作用，其形成可以填充傷口，機(jī)化異物，促進(jìn)傷口再上皮化等。而在傷口愈合的早期，肉芽組織中血管新生的多寡及質(zhì)量是影響創(chuàng)面愈合效率和疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［2］。血管再生的調(diào)控是調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合速度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前已證實促進(jìn)創(chuàng)傷部位血管形成的生長因子有成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor?β，TGF?β）等［3-4］。目前已有研究表明TGF?β對血管再生起著重要的調(diào)控作用。在血管再生模型中，根據(jù)TGF?β1含量的不同，它起著復(fù)雜的抑制或刺激作用。外源性TGF?β1刺激微血管向內(nèi)生長和分化，在創(chuàng)傷愈合過程中，新生血管形成肉芽組織中見有內(nèi)源性TGF?β1表達(dá)［5］。那么作為TGF?β超家族成員之一的活化素B（Activin B）［6］，對血管的新生有何作用，目前尚不清楚。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Activin B在活體水平促進(jìn)傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖遷移，提高皮膚創(chuàng)傷愈合率，促進(jìn)傷口的再上皮化［7］。但是Activin B對傷口愈合過程中其他生物學(xué)事件有何作用尚不清楚，本研究將探討Activin B在活體水平對小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合中血管再生的影響，采用小鼠全層皮膚切除模型，觀察Activin B對創(chuàng)面修復(fù)過程中肉芽組織增生的情況以及血管的再生，為細(xì)胞因子Activin B的治療應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級C57BL/6小鼠20只，6～8周，雌性，體質(zhì)量20～25 g，由自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)動物飼料喂養(yǎng)。

1.2儀器設(shè)備和試劑細(xì)胞因子Activin B購自R&D公司。CD31購自Abcam公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α?SMA）、Sabc二抗試劑盒（生物素化羊抗小鼠IgG、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物）和3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購置武漢博士德公司。石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)和烤片機(jī)，購自德國Leica，Leica正置顯微鏡購自德國Leica，皮膚微循環(huán)檢測儀（深圳市生強(qiáng)科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1小鼠皮膚創(chuàng)傷模型的制備20只C57BL/6小鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，小鼠背部兩側(cè)剪毛后用蜂蜜脫毛凍蠟脫毛，碘酒酒精常規(guī)消毒，在小鼠脊柱兩側(cè)采用直徑8 mm的打孔器各制備1個圓形全層皮膚缺損模型。術(shù)后動物自由進(jìn)食、水。

1.3.2給藥每只C57BL/6小鼠左邊為Activin B組，在創(chuàng)口四周皮下注射Activin B（10 ng/mL），每次0.2 mL，每天2次。右邊為PBS組，在創(chuàng)口四周皮下注射pH值7.4的無菌PBS，每次0.2 mL，每天2次。單只分籠飼養(yǎng)，整個實驗期間創(chuàng)口均為自然暴露狀態(tài)。

1.3.3創(chuàng)面愈合檢測每天觀察傷口愈合情況，并使用數(shù)碼相機(jī)記錄第0、3、5、7天傷口部位愈合情況，IPP圖像分析系統(tǒng)計算創(chuàng)面愈合率，愈合率=（原始創(chuàng)面面積－未愈合的創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.4創(chuàng)面血管觀察分別于傷后第3、5、7天斷髓處死小鼠，將創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍1 cm皮膚從深筋膜下方掀起并取下，用手電作光源，進(jìn)行創(chuàng)面透光試驗，觀察血管情況并拍攝記錄。

1.3.5組織學(xué)檢查及免疫組化分析于傷后第3、5、7天斷髓處死小鼠，對創(chuàng)口及創(chuàng)口周圍1 cm皮膚取材，用4%的多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片。HE染色檢測中，將石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，蘇木素染核，流水沖洗，自來水泛藍(lán)，用伊紅染胞質(zhì)，酒精梯度脫水，最后二甲苯透明后封片，在光學(xué)顯微鏡觀察傷口愈合情況及肉芽組織的生長及血管再生情況。免疫組化檢測，石蠟切片二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，置于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0），90℃熱修復(fù)10 min，自然冷卻后流水沖洗。3%雙氧水去內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，山羊血清室溫孵育40 min。4℃孵育一抗過夜。PBS沖洗，室溫孵育二抗40 min。PBS沖洗后DAB顯色。蘇木素復(fù)染，流水沖洗，自來水泛藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、封片。每組免疫組化結(jié)果選取高倍鏡下5個視野，計數(shù)陽性組織進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.6血流量分析傷后第3、5、7天，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，之后使用皮膚微循環(huán)檢測儀分別記錄3只小鼠兩側(cè)傷口（PBS組和Activin B組）中心統(tǒng)一大小區(qū)域的動態(tài)血流灌注量，記錄血流灌注量曲線，并記錄動態(tài)血流灌注量。每組3只小鼠，每個傷口部位取1 min內(nèi)的血流量（PF）數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)，計算1 min內(nèi)平均血流量值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)的表達(dá)形式是均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。整體比較采用重復(fù)測量方差分析，相同時間點(diǎn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面愈合皮膚創(chuàng)傷后第3和5天Activin B組傷口顯著小于PBS組（圖1A），統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Activin B組創(chuàng)面閉合率高于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 皮膚傷口愈合過程和傷口愈合率統(tǒng)計折線圖Fig.1 Time course of wound closureand statistical broken line graph of wound closure rate

2.2Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面周圍血管進(jìn)入肉芽組織術(shù)后第3、5及7天大體觀察皮膚傷口周圍血管的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，Activin B組肉芽組織周圍血管數(shù)量明顯多于PBS組（圖2A）。而第7天兩組間的血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明小鼠創(chuàng)傷的第7天已經(jīng)進(jìn)入傷口愈合的組織重塑階段，肉芽組織中血管數(shù)量開始減少。

圖2 Activin B促進(jìn)小鼠創(chuàng)面周圍血管進(jìn)入肉芽組織Fig.2 Activin B promotes blood vessels around the wound into granulation tissue

2.3Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面肉芽組織中血管再生，提高血流量H&E染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d Activin B組肉芽組織更成熟，成纖維細(xì)胞更多、新生毛細(xì)血管形成，而PBS組肉芽組織以炎癥細(xì)胞為主。術(shù)后第3和5天，如圖2B中黑色箭頭所示Activin B組肉芽組織內(nèi)部新生的薄壁毛細(xì)血管多于PBS組。免疫組化檢測周細(xì)胞標(biāo)記物α?SMA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，肉芽組織中周細(xì)胞數(shù)量高于PBS組（圖3A），根據(jù)統(tǒng)計分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)后第7天，兩組間周細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）。進(jìn)一步檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31（圖4A），結(jié)果也發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，肉芽組織中毛細(xì)血管數(shù)量高于PBS組，術(shù)后第7天，兩組間毛細(xì)血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）。利用皮膚微循環(huán)檢測儀檢測術(shù)后第3和5天肉芽組織中血流量（圖5），發(fā)現(xiàn)Activin B組（創(chuàng)面平均血流量高于PBS組P＜0.01）（圖5D），而術(shù)后第7天，Activin B組創(chuàng)面平均血流灌注量低于PBS組（P ＜0.01）（圖5C、D），這可能是由于Activin B已經(jīng)完成血管再上皮化，肉芽組織中血管減少。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測周細(xì)胞標(biāo)物α?SMA和兩組肉芽組織中周細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計分析Fig.3 α?SMA，the marker of pericyte were detected by immunocytochemicaland statistical bar chart of the number of pericyte in two groups′granulation tissue

圖4 免疫組織化學(xué)檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31和兩組肉芽組織中新生血管的數(shù)量統(tǒng)計柱狀圖Fig.4 CD31，the marker of vascular endothelial cell were detected by immunocytochemicaland statistical bar chart of the number of angiogenesis in two groups′granulation tissue

圖5 皮膚微循環(huán)檢測儀檢測同一只小鼠兩組傷口部位肉芽組織中平均血流量和平均血流量統(tǒng)計柱狀圖Fig.5 The blood flow in two groups′granulation tissue about the one mouse were detected by skin micro?circulation testing equipmentand Statistical bar chart of the mean blood flow

3 討論

創(chuàng)傷愈合是十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括早期止血、創(chuàng)面保護(hù)、炎癥控制及多種組織細(xì)胞的增生，新生血管的形成，創(chuàng)緣的爬行收縮等［8］。在傷口愈合的早期階段形成的肉芽組織在皮膚傷口愈合過程中具有重要的作用，血管的新生質(zhì)量和數(shù)量直接影響創(chuàng)傷部位的愈合效率。雖然目前已有研究證實部分細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合過程中促進(jìn)血管新生，但是因為傷口愈合過程的復(fù)雜性，血管再生的問題依然是傷口愈合尤其是難愈合性傷口研究的重點(diǎn)。

創(chuàng)面血管新生是指皮膚組織損傷后，在各種因素刺激下（如出血、缺血缺氧和炎性反應(yīng)等），在原有微血管床基礎(chǔ)上血管再生的過程，其為創(chuàng)傷部位提供氧、營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，因此對創(chuàng)面愈合起到了重要作用［9］。本研究在小鼠創(chuàng)面局部應(yīng)用Activin B后，創(chuàng)面閉合優(yōu)于PBS組。研究發(fā)現(xiàn)Activin B處理后傷口周圍深入至肉芽組織中的毛細(xì)血管增多，繼而在光鏡水平觀察，發(fā)現(xiàn)Activin B處理后傷口部位肉芽組織較成熟，較多新生血管、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。已有的研究認(rèn)為血管生成首先是通過內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，形成新生血管芽，此后血管芽在血流的沖擊下出現(xiàn)管腔，同時招募間質(zhì)中的周細(xì)胞貼附于新生血管，完成新生血管的塑型［10］。因此筆者利用血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物CD31免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Activin B組傷口部位肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組。在調(diào)節(jié)傷口部位血管再生的問題中，Activin B與TGF?β1具有類似的作用，但是外源性TGF?β1主要是通過刺激微血管向內(nèi)生長和分化發(fā)揮作用，那么Activin B是否通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)血管的新生，這將是未來可以探討的問題。

研究發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞能夠感受血管生成刺激，引導(dǎo)血管芽生，是血管生成的先驅(qū)者［11］。因此檢測周細(xì)胞的標(biāo)記物α?SMA可以反映血管再生［13］。在創(chuàng)傷愈合過程中周細(xì)胞可能來源于成纖維細(xì)胞［14］、內(nèi)皮細(xì)胞以及周圍毛細(xì)血管的周細(xì)胞等［15］。本研究發(fā)現(xiàn)肉芽組織中周細(xì)胞（α?SMA陽性）增多，一方面提示Activin B促進(jìn)傷口部位肉芽組織中血管的新生，另一方面也提示Activin B對血管新生過程中周細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF?β信號通過ALK5/Smad2/3信號通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化為周細(xì)胞［16］。PDGF?β及其受體通路在新生血管周細(xì)胞的募集中具有關(guān)鍵作用［17］。那么Activin B對周細(xì)胞有何作用，通過何種信號機(jī)制調(diào)節(jié)周細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)而調(diào)節(jié)血管的新生目前尚不清楚。

創(chuàng)傷愈合的病理情況有不愈合和過渡愈合兩種形式。不愈合主要是指那些不能正常上皮化的開放性創(chuàng)面。由于皮膚組織缺損較大，肉芽生長緩慢，血管新生及膠原沉積減慢［18］，局部血液供應(yīng)不良或者細(xì)菌感染等原因，導(dǎo)致細(xì)胞增殖不良、細(xì)胞老化或功能減退，因而需要較長時間修復(fù)。本研究在活體水平初步探討發(fā)現(xiàn)Activin B促進(jìn)傷口部位肉芽組織的生長，調(diào)節(jié)傷口部位血管的再生和血流灌注量，從而促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合。但是具體的調(diào)控機(jī)制尚未深入研究，因此下一步的研究計劃是在細(xì)胞水平研究Activin B對血管內(nèi)皮細(xì)胞以及周細(xì)胞的功能影響。深入探討Activin B在創(chuàng)面愈合過程中的血管再生的作用機(jī)制，將為臨床促進(jìn)難創(chuàng)愈合、糖尿病血管病變等疾病的治療提供新的思路。