劉麗敏 史文娟 何芳 胡海燕

深圳市婦幼保健院婦科（廣東深圳 518000）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA），1948年由ASHERMAN［1］首次描述，因?qū)m腔手術(shù)史帶來(lái)的創(chuàng)傷、宮腔感染（結(jié)核）、放射線（子宮動(dòng)脈栓塞術(shù)）等致使子宮內(nèi)膜發(fā)生纖維化，造成子宮腔和或?qū)m頸管腔出現(xiàn)部分或全部閉塞。月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、不孕或反復(fù)性流產(chǎn)、慢性盆腔痛等是IUA常見(jiàn)的臨床癥狀［2］，部分患者無(wú)明顯癥狀。目前IUA的主要治療方式是宮腔鏡下宮腔粘連松解術(shù)及術(shù)后宮腔內(nèi)放置物理屏障、輔助雌激素治療［3-4］。IUA的發(fā)展與子宮內(nèi)膜基底層損傷和子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙有關(guān)［1］，主要病理改變是炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)纖維蛋白原的聚集，進(jìn)而子宮內(nèi)膜纖維化［5］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF?β）信號(hào)被認(rèn)為是負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)合成的最有效的促纖維化途徑之一。而全反式維甲酸（all?trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的生物活性衍生物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡的作用［6-7］。最近的研究［8-10］表明，ATRA在一些纖維化疾病中發(fā)揮抗纖維化作用。SONG等［9］發(fā)現(xiàn)ATRA能阻斷TGF?β信號(hào)通路，減弱博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺部纖維化。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)ATRA與人宮腔粘連疾病的相關(guān)性研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TGF?β1作用原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（human endometrial stromal cells，HESCs）使其發(fā)生纖維化，進(jìn)而構(gòu)建IUA細(xì)胞模型，研究ATRA在IUA細(xì)胞水平中抗纖維化的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1標(biāo)本選取2016年5月至2017年5月，在深圳市婦幼保健院婦科，因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變、子宮漿膜下肌瘤及肌壁間肌瘤行子宮切除術(shù)或因不孕癥行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢術(shù)婦女的新鮮子宮內(nèi)膜8例，年齡30～45歲，經(jīng)周期規(guī)律（25～ 32 d），術(shù)前未應(yīng)用激素及宮內(nèi)放置節(jié)育器3個(gè)月以上，且術(shù)后病理提示子宮內(nèi)膜無(wú)病變。本研究獲得深圳市婦幼保健院倫理審查會(huì)通過(guò)，術(shù)前征得患者同意及簽署知情同意書(shū)。

1.1.2試劑試劑胎牛血清（NTC）；Recombinant Human TGF?β1（PeproTech）；Ⅰ型膠原酶、ATRA（Sigma）；兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗體、兔抗人角蛋白CK?18抗體（SANTA CRUZ）；兔抗人α?SMA單克隆抗體、兔抗人COL1A1多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L（CST）；兔抗人 SMAD4單克隆抗體（Abcam）；TRIzol re?agent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?熒光定量試劑盒（Ta?kara）；ECL（Millipore，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的提取及培養(yǎng)。原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的提取采用0.2%濃度的Ⅰ型膠原酶消化-篩網(wǎng)過(guò)濾。眼科剪將刮宮式取出的子宮內(nèi)膜組織盡量剪碎；加入0.2%Ⅰ型膠原酶4～5 mL，置入37℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化60 min；200～400目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液；1 000 r/min離心5 min，去上清，15%完全培養(yǎng)基重懸，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；6～8 h后更換培養(yǎng)基（去除未貼壁細(xì)胞），得到純化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。2～3 d換液，1∶3～1∶4比例傳代及凍存。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及鑒定。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及其變化。細(xì)胞鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)法（immunocytochemistry，ICC）法檢測(cè) Vimentin和CK?18的表達(dá)。方法如下：細(xì)胞種植24孔板，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次；0.5%Triton?100室溫孵育20 min，PBS洗滌3次；5%BSA室溫封閉20 min，去除封閉液；分別加入Vimentin抗體和CK?18抗體，陰性對(duì)照組PBS代替一抗，4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜；次日棄一抗，PBS洗滌3次；加入山羊抗兔二抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次；辣根過(guò)氧化酶親合素SABC，37℃孵育20 min，PBS洗滌4次；DAB顯色液，避光37℃孵育5～10 min，去離子水終止染色；蘇木素來(lái)復(fù)染細(xì)胞核，37℃孵育2 min，去離子水終止染色；常規(guī)梯度75%、85%、95%、100%乙醇脫水2 min，二甲苯透明1 min，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)TGF?β1誘導(dǎo)HESCs建立人宮腔粘連細(xì)胞模型及ATRA處理。0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF?β1作用于HESCs 48 h，qRT?PCR法檢測(cè)COL1A1、α?SMA mRNA表達(dá)。以10 ng/mL TGF?β1作用于HESCs 48 h，隨后0、0.1、1和10 μm/mL ATRA作用 48 h，qRT?PCR、WB檢測(cè)COL1A1、α?SMA、及SMAD4的mRNA和蛋白表達(dá)。

1.2.4蛋白表達(dá)qRT?PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞COL1A1、α?SMA、和SMAD4的mRNA的表達(dá)。TRIzol提取RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度及濃度，用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA。引物序列：COL1A1正向引物：5′?GAGGGCCAAGAC?GAAGACATC?3′，反向引物：5′?CAGATCACGTCAT?CGCACAAC?3′；α?SMA正向引物：5′?CGGGACATC?AAGGAGAAACT?3′，反向引物：5′?CCATCAGGCA?ACTCGTAACTC?3′；SMAD4正向引物：5′?CGGAT?TACCCAAGACAGAGC?3′，反向引物：5′?AAGGTT?GTGGGTCTGCAATC?3′；GAPDH 正向引物：5′?CG?GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT?3′，反向引物5′?A?GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC?3′。擴(kuò)增條件：首先95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s→60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95℃10 s→40℃60 s。

1.2.5Western blotWB法檢測(cè)各組細(xì)胞COL1A1、α?SMA、和SMAD4的蛋白表達(dá)。裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白；通過(guò)BCA?100蛋白定量法得出蛋白濃度；配制8%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行電泳；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入COL1A1抗體、α?SMA抗體、SMAD4抗體、GAPDH抗體，4℃過(guò)夜，1×TBST洗膜5 min×3次；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫下孵育1～2 h，1×TBST洗膜5 min×3次；條帶中加入ECL顯影液，超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并行方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析（One?Way ANOVA）比較多組間蛋白及mRNA表達(dá)水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HESCs的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞貼壁24 h后呈短梭形散在分布；72 h后，細(xì)胞伸展呈梭形或紡錘形，局部同心圓樣或洋蔥樣形成細(xì)胞集落。3代后細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，生長(zhǎng)旺盛，纖維樣貼壁生長(zhǎng)（圖1）。

2.2HESCs的細(xì)胞鑒定ICC法檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin染色陽(yáng)性，呈棕褐色；上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK?18陰性；PBS組陰性；CK?18與PBS組一致，進(jìn)而證實(shí)為純度較高的HESCs（圖2）。

圖1 HESCs細(xì)胞形態(tài)（100×）Fig.1 HESCsof different passages observed underan inverted fluorescence microscope（100 ×）

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色，進(jìn)行細(xì)胞鑒定（100×）Fig.2 Immunocytochemical staining was performed to identify HESCs under an inverted fluorescence microscope（100 ×）

2.3 COL1A1、α?SMA mRNA在各濃度TGF?β1組的表達(dá)qRT?PCR結(jié)果顯示：0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF?β1組COL1A1和α?SMA的mRNA表達(dá)均逐漸增加后下降，10 ng/mL TGF?β1組表達(dá)最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)選取10 ng/mL TGF?β1構(gòu)建人宮腔粘連細(xì)胞模型（圖3）。

圖3 COLIA1、α?SMA在不同濃度TGF?β1組的表達(dá)Fig.3 Therelative mRNA expression of COLIA1、α?SMA in HESCs after the treatments of diverse concentrations of TGF?β1

2.4α?SMA、COL1A1和SMAD4在10 ng/mL TGF?β1及各濃度ATRA組處理后的表達(dá)qRT?PCR及WB結(jié)果顯示，與NC組相比，1和10 μmol/mL ATRA組COL1A1、α?SMA和 SMAD4的mRNA和蛋白表達(dá)下降，其中1 μmol/mL ATRA組下降最明顯。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4、5）。

圖4 α?SMA、COLIA1及SMAD4 mRNA在10ng/mlTGF?β1、ATRA不同濃度作用組的表達(dá)Fig.4 Therelative mRNA expression of α?SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF?β1 and diverse concentrations of ATRA

圖5 α?SMA、COLIA1及 SMAD4 蛋白在10 ng/mL TGF?β1、ATRA不同濃度作用組的表達(dá)Fig.5 The relative proteins expressions of α?SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF?β1 and diverse concentrations of ATRA

3 討論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為IUA的病因與子宮受損有關(guān)，可能導(dǎo)致月經(jīng)異常，流產(chǎn)和不孕［3］。宮腔鏡手術(shù)已成為診斷及治療宮腔粘連的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)［11］。但對(duì)于中重度IUA的手術(shù)效果和預(yù)后生殖，因子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)不同步而不能滿足患者要求［12］。術(shù)后宮內(nèi)放置物理屏障：宮內(nèi)節(jié)育器和Interceed防粘連膜。Interceed防粘連膜費(fèi)用高，其5～7 d開(kāi)始吸收，28 d左右完全吸收，且部分患者出現(xiàn)術(shù)后宮內(nèi)感染癥狀，加重了粘連的發(fā)生。宮腔粘連是世界難題，其嚴(yán)重威脅著女性的生育功能及生殖健康，進(jìn)而影響家庭穩(wěn)定及社會(huì)的和諧發(fā)展。探索IUA的基因生物學(xué)機(jī)制，在IUA形成過(guò)程中應(yīng)有針對(duì)性地對(duì)子宮內(nèi)膜纖維化進(jìn)行治療是迫在眉睫的需求。

TGF?β1被公認(rèn)為是纖維化的啟動(dòng)因子。其可以激活包括SMAD［13］、MAPK途徑等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)纖維蛋白原的異常合成增多；TGF?β1能夠促進(jìn)多種細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞（MF），包括成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等，并能誘導(dǎo)其表達(dá)α?SMA，而α?SMA是研究MF轉(zhuǎn)分化的標(biāo)記物［14］。TGF?β1是誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）作為膠原蛋白過(guò)量沉積的器官纖維化的標(biāo)志［15-16］。本研究中TGF?β1作用HESCs后，COL1A1、α?SMA mRNA水平高表達(dá)，證實(shí)TGF?β1能夠誘使HESCs發(fā)生纖維化改變構(gòu)建IUA細(xì)胞模型，進(jìn)而為研究ATRA對(duì)IUA的纖維化的作用機(jī)制提供模型支持。

SMAD家族是TGF?β信號(hào)通路中重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。SMAD4與磷酸化的smad2/smad3結(jié)合后形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并與DNA元件結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)［17］。在本研究中，通過(guò)TGF?β1誘導(dǎo)HESCs后促使SMAD4升高激活該信號(hào)通路，導(dǎo)致COL1A1、α?SMA高表達(dá)。全反式維甲酸（ATRA）是維生素A的生物活性衍生物，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，增殖和凋亡的作用［6-7］。相關(guān)研究報(bào)道，ATRA可明顯抑制TGF?β/SMAD信號(hào)通路的激活［18］。本研究與其結(jié)論一致，在 IUA細(xì)胞模型中，ATRA抑制TGF?β/Smad信號(hào)通路，COL1A1、α?SMA的mRNA及蛋白水平明顯下降，改善細(xì)胞纖維化。因此，ATRA有減輕IUA的子宮內(nèi)膜再生修復(fù)中的纖維化的作用。ATRA相對(duì)成本低，改善Interceed防粘連膜費(fèi)用高情況，便于臨床宮腔粘連的預(yù)防和治療的應(yīng)用，有可能成為臨床預(yù)防與治療宮腔粘連的措施之一。