劉翔 耿和 吳宗林 施華娟 張濤

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200060）

在世界范圍內(nèi)，膀胱尿路上皮癌在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高［1］，它具有復發(fā)率高、易向肌層侵潤等特點［2］。近年來該病在我國的發(fā)病率有進行性增高的趨勢［3］，故對該病增殖、侵襲機制的研究能帶來明顯的科研及社會價值。 轉(zhuǎn)錄因子YY1（Yin?Yang1）是鋅指類核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合不同的輔助因子，參與細胞周期的調(diào)控、腫瘤的形成等多種生物學進程［4］。多項研究顯示YY1在包括膀胱癌在內(nèi)的多項惡性腫瘤中均有表達，并揭示YY1可能是導致正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞，并且促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子［5-6］。故我們設(shè)計本研究來觀察YY1在不同表達水平下對J82膀胱尿路上皮癌細胞的增殖、侵襲能力的影響，以探索YY1的表達水平與膀胱尿路上皮癌進展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑本研究起止時間為2017年4月至2018年4月。J82人膀胱尿路上皮癌細胞購自美國Sciencell公司。細胞培養(yǎng)液采用購自美國Hyclone公司。轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。兔抗人多克隆抗體YY1購自美國ProteintechT公司。Transwell小室購自美國Corning公司。酶標儀購自瑞士TECAN Nanoquant公司。靶向YY1序列的shRNA由上海齊合生物技術(shù)有限公司合成，依篩選出來的709、827、1186三個靶標位點進行制備。

1.2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將J82細胞在含10%FBS的MEM培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1天將J82細胞接種到（不含抗生素的培養(yǎng)基）6孔板中，每孔2 mL。等到細胞生長到80%～90%融合度時，將細胞分為三組：（1）空白組未進行轉(zhuǎn)染操作。（2）YY1增強表達組在Opti?MEM 250 μL中加入脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑10 μL，在室溫下孵育5 min，加入Opti?MEM 250 μL和搭載YY1的pFLAG?CMV4載體4 μg，轉(zhuǎn)染后6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染完成48 h后收集蛋白。（3）YY1沉默組轉(zhuǎn)染時采用pLKO.1puro載體搭載的shRNA，轉(zhuǎn)染方法同YY1增強表達組。

1.3Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達分別將空白組、YY1增強表達組、YY1沉默組的細胞充分裂解后離心取上清液。配制凝膠置于電泳槽中，取各個處理組蛋白提取液，與緩沖液混合后煮沸、離心，加入孔中進行電泳，將PVDF膜浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，修膠后制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，將轉(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中進行轉(zhuǎn)膜。封閉、洗膜后加入封閉液稀釋的YY1一抗和β?actin，孵育洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗。膜于化學發(fā)光檢測試劑中反應(yīng)后，在暗室中感光、顯影、定影。對膠片進行掃描，比較各組灰度值。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖能力J82細胞在10%FBS的MEM培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)0.25%胰酶消化，離心后用完全培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)。將空白組、YY1增強表達組、YY1沉默組的轉(zhuǎn)染混合物加到96孔板的孔底，然后每孔接種8 000個J82細胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h，然后在96孔板的每個孔中加入10 μL MTT，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后，棄去MTT和完全培養(yǎng)基，再加入100 μL DMSO，孵育后于酶標儀中檢測各孔在490 nm處的吸光度，繪制細胞增殖曲線。

1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲能力在24孔板和上室transwell insert中加入無血清培養(yǎng)液MEM，在37℃的培養(yǎng)箱里平衡一個h以增強細胞的粘附作用。將空白組、YY1增強表達組、YY1沉默組的細胞按3×104個接種在insert的上室內(nèi)，6 h之后將上室培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，下室為完全培養(yǎng)基。Corning Polycarbonate Membrane Insert置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，48 h后擦除未遷移跨膜的細胞，將小室置于干凈的24孔板中并加入0.6 mL 100%甲醇，室溫下固定10 min。固定完成后，在另外一個干凈的小孔中倒入一定量的0.1%的結(jié)晶紫進行染色30 min，清洗殘余染料，取膜后置于顯微鏡下拍照計數(shù)，計數(shù)小室中央10個隨機視野內(nèi)穿透膜的細胞數(shù)取平均值。

1.6統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗和單因素ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1YY1基因增強表達和沉默的效果對各組Western blotting蛋白印跡灰度值進行分析，使用β?actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示空白組與YY1增強表達組對比時，YY1蛋白表達水平分別為（5.73±0.30）和（8.14± 0.37），增強組的YY1表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。見圖1。對比709、827、1 186三個靶標位點制備的shRNA沉默YY1的表達效果，以1 186位點合成的shRNA效果最佳，故后續(xù)數(shù)據(jù)分析及實驗步驟均選取該位點shRNA轉(zhuǎn)染的J82細胞作為YY1沉默組。空白組和YY1沉默組對比時，YY1蛋白表達水平分別為（14.52±0.71）和（10.08±0.37），沉默組的YY1表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 增強表達后的J82細胞中YY1表達水平的改變Fig.1 Expression level of YY1 in J82 cells after enhanced expression

圖2 shRNA轉(zhuǎn)染后的J82細胞中YY1表達水平的改變Fig.2 Expression level of YY1 in J82 cells after shRNA transfection

2.2 MTT實驗依酶標儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，YY1沉默組、空白組、YY1增強表達組在490nm處的吸光度分別為（0.105±0.014）、（0.106±0.009）和（0.142±0.009）。培養(yǎng)48 h后，三組吸光度分別為（0.124±0.009）、（0.153±0.010）和（0.246±0.013）。培養(yǎng)72 h后，三組吸光度分別為（0.163 ± 0.028）、（0.234 ± 0.011）和（0.382 ± 0.018）。YY1增強表達組在各個時間節(jié)點的吸光度均高于空白組和YY1沉默組（P＜0.05）。培養(yǎng)24 h后空白組和YY1沉默組的吸光度無明顯區(qū)別（P＞0.05）。培養(yǎng)48 h和72 h后空白組吸光度明顯高于YY1沉默組（P＜0.05）。細胞增殖曲線顯示，YY1沉默組的增殖速率明顯低于YY1增強表達組。見圖3。

圖3 各組J82細胞增殖曲線Fig.3 J82 cell proliferation curve of each group

2.3 Transwell實驗隨機取10個小室中央視野，計數(shù)其內(nèi)穿透膜的細胞數(shù)取平均值，顯示YY1沉默組、空白組、YY1增強表達組視野內(nèi)的細胞計數(shù)分別為（7.2±3.6）、（54.4±6.7）和（56.6±10.7）。見圖4-7。樣本之間差異明顯（F=67.804，P＜0.05），其中YY1沉默組的細胞計數(shù)明顯小于空白組和YY1增強表達組（P＜0.05），空白組和YY1增強表達組之間無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 YY1沉默組中J82細胞的侵襲能力（×250）Fig.4 Invasion ability of J82 cells in YY1 silent expression group（× 250）

圖5 空白對照組中J82細胞的侵襲能力（×250）Fig.5 Invasion ability of J82 cells in control group（× 250）

圖6 YY1增強表達組中J82細胞的侵襲能力（×250）Fig.6 Invasion ability of J82 cells in YY1 enhanced expression group（× 250）

圖7 各組透膜細胞計數(shù)Fig.7 Number of invasive cells in each group

3 討論

腫瘤細胞增殖能力與細胞分裂周期密切相關(guān)。細胞分裂周期縮短，則在時間一定的條件下能分裂產(chǎn)生更多的細胞。而細胞周期的長短主要由合成前期（G1）決定，縮短合成前期，能有效地縮短細胞的整個分裂周期，從而促進細胞增殖能力的提升［7］。KANG等［8］研究者發(fā)現(xiàn)在體外沉默胃腺癌細胞中YY1的表達后，能使胃腺癌細胞停滯于G1期，同時引起胃腺癌細胞凋亡。此研究還提示敲除YY1的胃腺癌細胞的通過抑制Wnt通路從而表現(xiàn)為擴散能力受限制。同樣的現(xiàn)象被CHOW KH在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)［9］。筆者應(yīng)用ShRNA干擾技術(shù)這一高效、特異的基因沉默手段，成功制備了敲低YY1表達的J82細胞模型。通過對YY1增強表達、YY1正常表達和敲低YY1表達的J82細胞進行實驗比較各組的增殖能力，發(fā)現(xiàn)敲低YY1表達的J82細胞的增殖能力在各個時間節(jié)點均明顯弱于YY1增強表達的J82細胞，僅在培養(yǎng)24 h后與空白組的J82細胞達到相近水平，而在48 h和72 h后，亦被空白組明顯超越。此結(jié)果與上述研究者的研究結(jié)果相符，提示YY1被沉默后可能延長惡性腫瘤的G1期以減弱其增殖能力。YY1在膀胱尿路上皮癌中發(fā)揮作用的具體機制還有待進一步研究，受KANG等［8］作者研究結(jié)果的啟示，推測該機制與Wnt通路可能存在關(guān)聯(lián)。

腫瘤細胞的侵襲能力受多種因素影響。Tran?swell實驗反映的是腫瘤細胞降解細胞外基質(zhì)的能力，該過程是腫瘤細胞通過分泌蛋白降解酶來完成。基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是此類蛋白降解酶中具有代表性的一類，近年來大量研究顯示MMPs在人類多種惡性腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的促進的作用［10-11］。我們通過分析Tran?swell實驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)YY1沉默組中J82細胞的侵襲能力明顯弱于空白對照組和YY1增強表達組，而對比空白組和YY1增強組中J82細胞的侵襲能力則未發(fā)現(xiàn)明顯差異。聯(lián)想到MMPs在腫瘤細胞侵襲過程中的重要作用，筆者試圖尋找YY1與MMPs之間相互作用的證據(jù)以解釋上述結(jié)果。NIE等［12］在食管鱗狀細胞癌細胞中發(fā)現(xiàn)沉默YY1表達后可抑制該腫瘤細胞的擴散和侵潤，其過程與MMP2和MMP9的表達受抑制相關(guān)。ZHENG等［13］在胃癌細胞中發(fā)現(xiàn)沉默YY1后可以明顯減弱MMP14的作用，從而抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移，同時取決于MMP14水平的不同，YY1在胃癌轉(zhuǎn)移的過程中可正向或負向調(diào)節(jié)MMP14的功能。故筆者推測膀胱尿路上皮的侵襲能力可能受到Y(jié)Y1調(diào)節(jié)后的MMPs表達的影響，同時MMPs的表達不一定總是隨著YY1表達的增強而同時增強，或許存在某種受MMPs水平所決定的反饋機制，導致本實驗結(jié)果中空白組和YY1增強組J82細胞的侵襲能力無明顯差異，這有待在膀胱尿路上皮癌細胞中對不同YY1表達水平下的MMPs作進一步的檢測來尋找線索。

前文中提到，筆者發(fā)現(xiàn)有關(guān)研究提示W(wǎng)nt通路可能參與了腫瘤細胞的增殖過程，在腫瘤細胞的侵襲過程中，我們同樣發(fā)現(xiàn)了類似的線索。DU等［14］發(fā)現(xiàn)當人類膀胱癌細胞中Wnt通路被激活后，通路中的重要因子β?catenin水平升高，刺激MMP9水平也升高從而增強膀胱癌的侵襲能力。結(jié)合其他作者在他們的研究中發(fā)現(xiàn)YY1可影響MMPs表達水平的結(jié)論，推測Wnt通路很可能是YY1作用于MMPs的中間通路，有待進一步研究的證明。

膀胱尿路上皮癌的增殖和侵襲均是十分復雜的過程，我們的研究結(jié)果提示沉默YY1基因可減弱J82膀胱尿路上皮癌細胞的增殖和侵襲能力，對其進行進一步研究有利于揭示膀胱尿路上皮癌進展的機制，為針對該腫瘤的治療提供具有前景的作用靶點。