賈曉艷，李 俊，劉 萍，楊宏山

西妥昔單克隆抗體是結(jié)直腸癌分子靶向治療最常用的藥物，通過阻斷EGFR-Ras-Raf-MAPK途徑達(dá)到抗腫瘤作用。在西妥昔單抗治療中，κ-ras基因突變可導(dǎo)致生長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)下傳而耐藥，κ-ras基因突變狀態(tài)也成為結(jié)直腸癌精準(zhǔn)治療的重要組成部分［1］。該研究檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織中表皮生長(zhǎng)因子受體 （epithelial growth factor receptor，EGFR）表達(dá)與κ-ras基因突變及κ-ras蛋白表達(dá)的關(guān)系，探討其與結(jié)直腸癌病例特征的關(guān)系，為臨床篩選西妥昔單抗受益人群提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取孝感市中心醫(yī)院2016年—2017年間手術(shù)切除的結(jié)直腸組織標(biāo)本95例，其中結(jié)腸癌19例，直腸癌76例。樣本對(duì)應(yīng)的患者中，男57例，女38例；年齡45～89 歲，其中年齡＜60歲34例，≥60歲61例；發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例；TNM分期 （2016結(jié)直腸癌AJCC/UICC TNM分期第八版標(biāo)準(zhǔn)）Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期80例。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組化染色 全部病例均經(jīng)中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化。采用檸檬酸鹽高溫高壓修復(fù)，3%過氧化氫溶液浸泡以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS緩沖液震蕩沖洗。一抗室溫（25℃）孵育1 h，二抗室溫孵育80 min 30 s。DBA顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，流水返藍(lán)，風(fēng)干后中性樹膠封片。以已知陽(yáng)性切片作為對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 組織DNA抽提與測(cè)定 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒進(jìn)行石蠟包埋組織樣本DNA的提取。提取出的樣品在多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及基因突變檢測(cè) PCR反應(yīng)擴(kuò)增κ-ras第2外顯子，目的片段長(zhǎng)度167 bp。上游引物5'-AGGCCTGCTGAAAATGACT-3'（forward）；下 游引物 5'-AATGGTCCTGCACCAGTAA-3'（reverse）。反應(yīng)步驟與條件見表1。將PCR產(chǎn)物置于Light Scanner中，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行基因突變檢測(cè)。

表1 PCR反應(yīng)步驟與條件

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 免疫組織化學(xué) EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞膜及部分近細(xì)胞膜的胞質(zhì)可見黃色顆粒，κ-ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)可見黃色顆粒。高倍鏡下選擇4個(gè)視野，按照腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)弱計(jì)分，未見染色計(jì)分0分，淡黃色計(jì)分1分，棕黃色計(jì)分2分，深棕色、棕褐色、粗顆粒計(jì)分3分。按照陽(yáng)性細(xì)胞占所有結(jié)直腸癌細(xì)胞的比例計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞比例低于25%計(jì)分1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～50%計(jì)分2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例50%～75%計(jì)分3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例高于75%計(jì)分4分。染色程度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分的乘積為總得分，總得分≥3分為蛋白表達(dá)陽(yáng)性，＜3分為陰性。由兩位以上資深病理科醫(yī)師雙盲閱片，得出結(jié)果。

1.3.2 高分辨率熔解曲線 將收集到的熒光信號(hào)，分別與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、空白對(duì)照對(duì)比，確定樣本突變狀態(tài)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理，統(tǒng)計(jì)方法采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況如圖1所示，EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性率為81.1%（77/95），在結(jié)腸癌與直腸癌中表達(dá)率分別為78.9%、81.6%。EGFR蛋白表達(dá)與患者其他臨床病理指標(biāo)如性別、年齡，腫瘤發(fā)生部位、浸潤(rùn)深度、腫瘤長(zhǎng)徑、大體分型、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移及TNM分期等無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。

圖1 EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SP×200）

2.2 κ-ras基因在結(jié)直腸癌組織中的突變情況結(jié)直腸癌組織中κ-ras基因的突變頻率為36.8%（35/95），其中結(jié)腸癌突變率為 42.1%（8/19），直腸癌突變率為35.5%（27/76）。突變型熔解曲線如圖3、圖4所示。基因突變與患者臨床病理指標(biāo)如性別、年齡，腫瘤發(fā)生部位、浸潤(rùn)深度、腫瘤長(zhǎng)徑、大體分型、轉(zhuǎn)移及TNM分期之間無顯著相關(guān)關(guān)系 （P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表 2。

表2 結(jié)直腸癌組織中EGFR蛋白表達(dá)、κ-ras基因突變及κ-ras蛋白表達(dá)情況

圖2 EGFR蛋白陰性表達(dá)（SP×200）

圖3 κ-ras基因第2外顯子突變曲線

圖4 κ-ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SP×200）

2.3 κ-ras蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況如圖5所示，κ-ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性率60.0%（57/95）。κ-ras蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的分化程度相關(guān)，高中分化組、低分化組的陽(yáng)性率分別為 66.7%（38/74），50.0%（19/21），P=0.003，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；κ-ras蛋白表達(dá)與患者其他臨床病理指標(biāo)如性別、年齡，腫瘤發(fā)生部位、浸潤(rùn)深度、腫瘤長(zhǎng)徑、大體類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。

2.4 EGFR蛋白表達(dá)與κ-ras基因突變，EGFR蛋白表達(dá)與κ-ras蛋白表達(dá)，κ-ras基因突變?chǔ)?ras蛋白表達(dá)的相關(guān)性 EGFR陽(yáng)性表達(dá)組κ-ras基因突變率為35.1%，EGFR陰性表達(dá)組κ-ras基因突變率44.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。EGFR陽(yáng)性表達(dá)組κ-ras蛋白表達(dá)率與陰性表達(dá)組為59.7%和61.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。κ-ras突變型組κ-ras蛋白表達(dá)率為65.7%，野生型組表達(dá)率為56.7%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表5）。

表3 EGFR蛋白表達(dá)與κ-ras基因突變的關(guān)系

表4 EGFR蛋白表達(dá)與κ-ras蛋白表達(dá)的關(guān)系

表5 κ-ras基因突變與κ-ras蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌分子靶向治療中，最常用的藥物為西妥昔單抗［2］。西妥昔單抗是抗EGFR單克隆抗體，可與EGFR特異性結(jié)合，通過與EGF、TGF-α競(jìng)爭(zhēng)受體，抑制生長(zhǎng)信號(hào)下傳，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，多用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌二、三線治療［3］。然而，在應(yīng)用過程中，發(fā)現(xiàn)部分患者應(yīng)用西妥昔單抗療效不明顯，可能與耐藥有關(guān)。針對(duì)西妥昔單抗耐藥，可能的機(jī)制包括：EGFR在結(jié)直腸癌中低表達(dá)或不表達(dá)，EGFR信號(hào)通路中下游某些基因自發(fā)激活，如κ-ras、nras、b-raf、PI3K突變導(dǎo)致的自發(fā)激活及其編碼蛋白的自發(fā)激活等［4，5］，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)［6］。EGFR 作為西妥昔單抗的作用靶點(diǎn)，在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［7］。但目前尚未發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后及西妥昔單抗的療效有確定性影響［8］。

κ-ras突變狀態(tài)是判斷患者對(duì)西妥昔單抗治療是否耐藥的重要依據(jù)，故在使用前需對(duì)患者腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否有從該藥物中獲益的可能。另一方面，西妥昔單抗價(jià)格高昂，盲目使用不僅給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能延誤治療，失去最佳治療時(shí)機(jī)。因此，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN指南）明確指出，在應(yīng)用含西妥昔單抗的方案治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的患者前，均應(yīng)先檢測(cè)腫瘤κ-ras基因的突變狀態(tài)，如該基因?yàn)橥蛔冃?，則西妥昔單抗耐藥的可能性大，不推薦使用。然而，并非κras基因?yàn)橐吧偷幕颊呔軓奈魍孜魡慰怪蝎@益，ras基因家族中的n-ras基因突變也可導(dǎo)致患者對(duì)西妥昔單抗治療失?。?］，這部分患者常混雜在κras基因野生型的患者中。除此之外，EGFR信號(hào)通路下游的b-raf基因突變也可導(dǎo)致西妥昔單抗耐藥。b-raf基因突變還提示腫瘤預(yù)后不良，但b-raf抑制劑未能顯示抗腫瘤活性［10］。故在條件許可的情況下，應(yīng)對(duì)患者可能影響西妥昔單抗療效的分子標(biāo)志物均進(jìn)行檢測(cè)，最大限度地保證西妥昔單抗治療的療效。

目前實(shí)驗(yàn)室κ-ras基因突變檢測(cè)方法有多種，例如測(cè)序法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)序法（PCR-RFLP）、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 （PCR-SSCP）、探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、高分辨率熔解曲線法等，各種檢測(cè)方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)。該研究使用的HRM是近年來興起的一種新的基因突變掃描方法，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、高通量的優(yōu)點(diǎn)，而且全程閉管操作，不會(huì)因交叉污染而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。目前也已經(jīng)有研究證實(shí)HRM技術(shù)檢測(cè)基因突變與其他基因突變檢測(cè)技術(shù)相比，具有準(zhǔn)確、敏感、操作簡(jiǎn)便，且價(jià)格較低的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際應(yīng)用中具有巨大的潛力［11，12］。HRM技術(shù)不僅可以檢測(cè)已知突變，還可以掃描未知突變，但若需明確突變類型，仍需采用其他檢測(cè)方法進(jìn)一步檢測(cè)突變類型。

該研究中，EGFR陽(yáng)性表達(dá)率為81.1%，提示大部分結(jié)直腸癌患者存在EGFR單抗類藥物靶點(diǎn)。其中EGRR陽(yáng)性表達(dá)組κ-ras蛋白表達(dá)率與陰性表達(dá)組分別為59.7%、61.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示EGFR蛋白表達(dá)對(duì)κ-ras蛋白表達(dá)無明顯影響。κras突變型組κ-ras蛋白表達(dá)率為65.7%，野生型組表達(dá)率為56.7%，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，提示不能通過κ-ras蛋白表達(dá)情來預(yù)測(cè)κ-ras基因突變狀態(tài)。κ-ras突變對(duì)信號(hào)鏈的影響可能并不是通過蛋白表達(dá)率來實(shí)現(xiàn)的，突變可能影響κ-ras蛋白功能，通過使低度活性的蛋白處于持續(xù)活化狀態(tài)促進(jìn)生長(zhǎng)信號(hào)的傳遞。EGFR蛋白、κ-ras基因與κ-ras蛋白均從一定程度上促進(jìn)了腫瘤的演進(jìn)，但三者之間如何相互作用仍不甚清楚，需要大樣本的檢測(cè)與更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。未來將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的方法與技術(shù)，更好地篩選分子靶向藥物而使人群受益。