謝少利 ，王碧娟，劉家有，李金穗，趙小波，鄧世山，侯令密

（1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 內(nèi)科，四川 南充 637000；3. 川北醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，四川 南充 637000）

三陰性乳腺癌（three negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌分子分型中的一種特殊亞型，因其特殊的生物學(xué)特性，導(dǎo)致三陰性乳腺癌具有進(jìn)展快、預(yù)后差等特點(diǎn)。因?yàn)槿狈?nèi)分泌治療和靶向治療的特異性位點(diǎn)，所以除了化療臨床上尚無有效的綜合治療手段。蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，正常機(jī)體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生與降解維持著動(dòng)態(tài)平衡。其產(chǎn)生受基因調(diào)控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑（ubiquitin proteasome system，UPS），后者因?yàn)樘禺愋缘姆核氐鞍走B接酶E3（UBE3），導(dǎo)致其降解蛋白質(zhì)具有高度選擇性[1-2]，正因?yàn)槿绱?，有越來越多的藥物針?duì)UPS系統(tǒng)作為治療靶標(biāo)[2-4]。UBE3A為UBE3酶之一，前期實(shí)驗(yàn)[5-9]發(fā)現(xiàn)，UBE3在乳腺癌組織中比癌旁組織中高表達(dá)，說明UBE3A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)shRNA下調(diào)UBE3A觀察三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-MB231的生物學(xué)行為，旨在進(jìn)一步研究三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，并期待為臨床治療和研究提供新靶點(diǎn)和新方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與分組

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，購于中國科學(xué)院細(xì)胞總庫。將細(xì)胞分為干擾組（轉(zhuǎn)染含UBE3A shRNA片段的慢病毒，包括3種干擾序列，選擇干擾效率最高的干擾序列行后續(xù)實(shí)驗(yàn)）、空白對(duì)照組（無任何處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染含陰性對(duì)照shRNA序列的慢病毒）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等購于德國Leica；酶標(biāo)儀、SDSPAGE電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、成像儀、PCR儀購于美國Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于德國Heraeus。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone公司；UBE3A siRNAs片段、Negative siRNA片段、GV-115中國上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體Lipo-2000、Trans IT購于美國Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR游引購于物美國Thermo；Western blot相關(guān)試劑購于中國碧云天公司；兔抗人UBE3A單克隆抗體（貨號(hào)：ab126765）、兔抗人β-actin（貨號(hào)：ab8227）多克隆抗體購于美國Abcam；Transwell小室購于美國Millipore；Matrigel購于美國BD。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 構(gòu)建及鑒定慢病毒質(zhì)粒載體 通過Genebank查詢?nèi)薝BE3A基因（NM-130839）序列，針對(duì)人UBE3A基因按RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)的3個(gè)RNA干擾序列與陰性對(duì)照序列見表1。使用AgeI，EcoRI內(nèi)切酶在酶切反應(yīng)體系中于相應(yīng)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切反應(yīng)，利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。在制備新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取大腸桿菌質(zhì)粒并將PCR擴(kuò)增，將PCR陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列正確的重組質(zhì)粒才可以進(jìn)行擴(kuò)增及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 設(shè)計(jì)的shRNA序列Table1 The designed shRNA seqeunces

1.4.2 包裝含目的片段的慢病毒 于5%的CO2孵箱培養(yǎng)用于包裝慢病毒的239T、MDA-MB-231細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清的1640培養(yǎng)基；并分別加入預(yù)先混勻的 LV-UBE3A-shRNA 載體 20 μg，pHelper 2.0載體 10 μg、pHelper 1.0載體 15 μg和 Lipo2000轉(zhuǎn)染溶液進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h后的培養(yǎng)293T細(xì)胞的上清液，于4 ℃、4000r/min離心10 min，收集含目的片段的慢病毒，并采用熒光法測(cè)病毒滴度測(cè)定以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.4.3 感染目的細(xì)胞 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDA-MB-231細(xì)胞、制成細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度，培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞融合度達(dá)到約20%～30%時(shí)，加入適宜量含目的片段的慢病毒，培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基；于熒光顯微鏡下觀察感染72 h后細(xì)胞GFP的表達(dá)情況，與普通光學(xué)顯微鏡下比較，熒光率＞90%者，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 篩選最佳干擾片段 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA。同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)各組細(xì)胞UBE3A基因相對(duì)表達(dá)水平，利用2-△△Ct法計(jì)算UBE3A相對(duì)表達(dá)水平，篩選干擾效率最高的干擾片段。

1.4.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算含20 μg蛋白的溶液的體積為上樣量，按常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉，加入一抗4 ℃過夜，再次洗膜后孵育二抗1 h，BeyoECL Plus試劑盒顯色及成像，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，使用凝膠圖像軟件Image Lab數(shù)據(jù)分析。

1.4.6 CCK8法檢測(cè)UBE3A細(xì)胞增殖 分別于轉(zhuǎn)染 24、48、72 h后每孔加入 CCK8試劑 10 μL，于培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值分析細(xì)胞增值情況；每次取5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.4.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取生長(zhǎng)良好處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞密度至2×104/mL；取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell上室，下室加入500 μL含10%的FBS培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，后用1%的結(jié)晶紫染色微孔膜下室的細(xì)胞10 min，PBS輕輕沖洗干凈后稍微晾干，于倒置顯微鏡觀察。每組10個(gè)高倍視野觀察通過Transwell小室的MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量，以反映腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力的大小。

1.4.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況 取生長(zhǎng)良好的各組細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液;離心收集細(xì)胞，加入3 mL預(yù)冷（-20 ℃）70%乙醇到細(xì)胞沉淀中，重懸細(xì)胞，于4 ℃固定過夜；再次離心收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次后離心收集細(xì)胞，加入500 μL PBS 含 50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2%Triton X-100，于4 ℃避光孵育30 min；調(diào)整細(xì)胞密度，設(shè)置參數(shù)，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用Graphpad 7對(duì)結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 shRNA載體陽性克隆測(cè)序結(jié)果

將設(shè)計(jì)合成的UBE3A靶點(diǎn)序列在基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)該序列與其它編碼同源，且重組質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序分析驗(yàn)證，與預(yù)期序列相符。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率

根據(jù)同一視野下白光和熒光細(xì)胞數(shù)目如圖1，干擾組轉(zhuǎn)染率均在95%以上，可進(jìn)行后續(xù)基因功能實(shí)驗(yàn)。

2.3 最有效干擾片段的篩選

慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)UBE3A及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA，獲得各組細(xì)胞的擴(kuò)增曲線及各組細(xì)胞UBE3A及GAPDH的Ct值，利用溶解曲線判斷PCR產(chǎn)物的特異性。以GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，使用2-△△Ct法分析各基因的Ct值，2-△△Ct值即為基因的相對(duì)表達(dá)量。以空白對(duì)照組為參考比較，其中陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.861，P=0.136）；3個(gè)干擾組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（干擾序列1：t=18.907，P=0.000046；干擾序列2：t=0.196，P=0.00000517；干擾序列3：t=71.925，P=0.00000293），其中，干擾序列3的干擾效率較高，達(dá)89.5%，故采用干擾序列3序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞（同一視野，×50） A：普通光學(xué)顯微鏡下；B:熒光顯微鏡下Figure1 MDA-MB-231 cells 48 h after lentiviral transfection (the same field of view, ×50) A: Under light microscope; B: Under fluorescence microscope

圖2 各組MDA-MB-231細(xì)胞UBE3A mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure2 The relative mRNA expression levels in each group of cells

2.4 干擾后UBE3A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

病毒感染細(xì)胞72 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白檢，檢測(cè)UBE3A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見圖3，以Image J進(jìn)行灰度分析和標(biāo)化。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），干擾組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.488，P=0.010），其相對(duì)表達(dá)量為54.7%，抑制率為45.3%，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 Western blot檢測(cè)UBE3A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Figure3 The relative mRNA expression levels determined by Western blot

2.5 Transwell檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），干擾組與空白對(duì)照組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.450，P=0.000）（圖4）。

圖4 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力Figure4 Cell invasion abilities detected by Transwell assay

2.6 細(xì)胞增殖能力的變化

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，測(cè)各組450 nm處OD值，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；干擾組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t24h=2.314，P=0.039；t48h=3.498，P=0.008；t72h=7.657，P=0.000）（圖5）。

圖5 各組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)OD值Figure5 OD values of each group of cells at different time points

2.7 細(xì)胞周期的變化

轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期，3組細(xì)胞在各個(gè)周期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（G0/G1期：F=243.712，P=0.000；G2/M期：F=29.804，P=0.001；S期：F=252.522，P=0.000）。其中陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組在細(xì)胞周期各時(shí)期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；干擾組與空白對(duì)照組比較，各時(shí)期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），干擾UBE3A后，MDAMB-231細(xì)胞大多數(shù)處于S期（圖6）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期Figure6 Cell cycles of each group of cells examined by flow cytometry

3 討 論

蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，正常機(jī)體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生與降解維持著動(dòng)態(tài)平衡。其產(chǎn)生受基因調(diào)控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和UPS，后者具有高度選擇性[2]，正因?yàn)槿绱?，有越來越多的藥物針?duì)UPS系統(tǒng)作為治療靶標(biāo)[3-4,10]，比如bortezomib和carfilzomib靶向藥物。UPS由泛素（UB）、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素蛋白連接酶E3、泛素延長(zhǎng)酶E4、去泛素化酶DUB（DUB）和26S的蛋白酶體組成。到目前為止，發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種E1酶，約30種的E2酶，約600種E3酶[1]。在UPS中由于E3酶獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能域，決定了其介導(dǎo)的靶蛋白降解反應(yīng)的高度選擇性與特異性。UBE3A又稱E6-AP（E6 associated protein，E6-AP），屬于含有HECT結(jié)構(gòu)的E3泛素蛋白連接酶家族成員。UBE3A基因可編碼5種mRNA，最終編碼3種同分異構(gòu)體的蛋白亞型[11]。每一種亞型的具體功能現(xiàn)在還不完全清楚。目前的研究[12-13]表明，UBE3A蛋白定位在細(xì)胞核中，作為甾醇類激素受體的共激活因子調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄參與天使綜合征（Angelic Syndrome，AS），研究[5,14-19]證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)大量的基因編碼的蛋白質(zhì)如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本次選取乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231來源于三陰性乳腺癌患者，惡性程度較高，具有較強(qiáng)的侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)首先以UBE3A基因?yàn)榘袠?biāo)，按照RNAi原則設(shè)計(jì)出3條siRNA和1條陰性對(duì)照，按照小干擾片段設(shè)計(jì)合成shRNA表達(dá)載體，同時(shí)使用慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，以此來增加轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞的增殖是活細(xì)胞在行使各種生理功能時(shí)重要的生物學(xué)特征之一，是生物體新陳代謝的表現(xiàn)，是生物體遺傳、分裂繁殖、生長(zhǎng)、發(fā)育的基礎(chǔ)[20]。細(xì)胞的增殖周期即指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始生長(zhǎng)，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程，可分為間期和分裂期。間期又可分為G0期（休眠期）、G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）。因此如果阻斷某些蛋白的合成如組蛋白、微管蛋白等，細(xì)胞將停止間期而不能進(jìn)入有絲分裂，從而影響細(xì)胞周期[20]。

本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，成功下調(diào)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 UBE3A基因及蛋白的表達(dá)。下調(diào)UBE3A后乳腺癌細(xì)胞的增殖能力較空白組及陰性對(duì)照組受到抑制，這也應(yīng)證了前期Zhou等[7]和侯令密等[8-9]的研究結(jié)果，且下調(diào)UBE3A表達(dá)后的乳腺癌細(xì)胞與對(duì)照組相比較，多的處于S期，即DNA合成期。換言之，下調(diào)UBE3A的細(xì)胞無法正常進(jìn)入分裂期，從而顯示出較低的增值能力。同時(shí)在Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中顯示，下調(diào)UBE3A表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力降低。這可能是因?yàn)閁BE3A作為UPS中關(guān)鍵酶之一降解細(xì)胞周期相關(guān)的的蛋白，參與了基因的調(diào)控，抑制了DNA的合成，從而使下調(diào)UBE3A后的乳腺癌細(xì)胞較多的處于S期，顯示出較低的增值能力[21-22]；還可能是因?yàn)橄抡{(diào)UBE3A后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路發(fā)生改變[23-24]，或者某些抑癌基因未受到UBE3A介導(dǎo)的蛋白降解[5,21,25]，致使乳腺癌細(xì)胞侵襲能力減弱。

總之，下調(diào)UBE3A表達(dá)后，三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期以及細(xì)胞的侵襲能力等生物學(xué)行為發(fā)生變化，提示UBE3A在三陰性乳腺癌細(xì)胞中扮演著重要角色，其可能是三陰性乳腺癌治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。當(dāng)然其具體參與機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

下調(diào)UBE3A表達(dá)后，三陰性乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231的增殖能力降低、侵襲能力降低以及細(xì)胞周期發(fā)生變化，提示UBE3A在三陰性乳腺癌細(xì)胞中扮演著重要角色，其可能是乳腺癌治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。