謝少利 ，王碧娟，劉家有，李金穗，趙小波，鄧世山，侯令密

（1. 川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 內(nèi)科，四川 南充 637000；3. 川北醫(yī)學院解剖學教研室，四川 南充 637000）

三陰性乳腺癌（three negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌分子分型中的一種特殊亞型，因其特殊的生物學特性，導致三陰性乳腺癌具有進展快、預后差等特點。因為缺乏內(nèi)分泌治療和靶向治療的特異性位點，所以除了化療臨床上尚無有效的綜合治療手段。蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，正常機體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生與降解維持著動態(tài)平衡。其產(chǎn)生受基因調(diào)控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑（ubiquitin proteasome system，UPS），后者因為特異性的泛素蛋白連接酶E3（UBE3），導致其降解蛋白質(zhì)具有高度選擇性[1-2]，正因為如此，有越來越多的藥物針對UPS系統(tǒng)作為治療靶標[2-4]。UBE3A為UBE3酶之一，前期實驗[5-9]發(fā)現(xiàn)，UBE3在乳腺癌組織中比癌旁組織中高表達，說明UBE3A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有促進作用。本實驗通過對shRNA下調(diào)UBE3A觀察三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-MB231的生物學行為，旨在進一步研究三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制，并期待為臨床治療和研究提供新靶點和新方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與分組

人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，購于中國科學院細胞總庫。將細胞分為干擾組（轉(zhuǎn)染含UBE3A shRNA片段的慢病毒，包括3種干擾序列，選擇干擾效率最高的干擾序列行后續(xù)實驗）、空白對照組（無任何處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染含陰性對照shRNA序列的慢病毒）。

1.2 主要實驗儀器

流式細胞儀購于美國BD公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等購于德國Leica；酶標儀、SDSPAGE電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、成像儀、PCR儀購于美國Bio-Rad公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購于德國Heraeus。

1.3 實驗主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone公司；UBE3A siRNAs片段、Negative siRNA片段、GV-115中國上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體Lipo-2000、Trans IT購于美國Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR游引購于物美國Thermo；Western blot相關(guān)試劑購于中國碧云天公司；兔抗人UBE3A單克隆抗體（貨號：ab126765）、兔抗人β-actin（貨號：ab8227）多克隆抗體購于美國Abcam；Transwell小室購于美國Millipore；Matrigel購于美國BD。

1.4 實驗方法

1.4.1 構(gòu)建及鑒定慢病毒質(zhì)粒載體 通過Genebank查詢?nèi)薝BE3A基因（NM-130839）序列，針對人UBE3A基因按RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計的3個RNA干擾序列與陰性對照序列見表1。使用AgeI，EcoRI內(nèi)切酶在酶切反應體系中于相應酶切位點進行酶切反應，利用T4DNA連接酶進行連接反應。在制備新鮮大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)化，提取大腸桿菌質(zhì)粒并將PCR擴增，將PCR陽性克隆進行測序，測序序列正確的重組質(zhì)粒才可以進行擴增及后續(xù)實驗。

表1 設(shè)計的shRNA序列Table1 The designed shRNA seqeunces

1.4.2 包裝含目的片段的慢病毒 于5%的CO2孵箱培養(yǎng)用于包裝慢病毒的239T、MDA-MB-231細胞。當細胞密度達60%～70%時將細胞培養(yǎng)基更換為無血清的1640培養(yǎng)基；并分別加入預先混勻的 LV-UBE3A-shRNA 載體 20 μg，pHelper 2.0載體 10 μg、pHelper 1.0載體 15 μg和 Lipo2000轉(zhuǎn)染溶液進行細胞轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h后的培養(yǎng)293T細胞的上清液，于4 ℃、4000r/min離心10 min，收集含目的片段的慢病毒，并采用熒光法測病毒滴度測定以確保后續(xù)實驗的準確性。

1.4.3 感染目的細胞 取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231細胞、制成細胞懸液；調(diào)整細胞濃度，培養(yǎng)24 h；待細胞融合度達到約20%～30%時，加入適宜量含目的片段的慢病毒，培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基；于熒光顯微鏡下觀察感染72 h后細胞GFP的表達情況，與普通光學顯微鏡下比較，熒光率＞90%者，可用于后續(xù)實驗。

1.4.4 篩選最佳干擾片段 使用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA。同時逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測各組細胞UBE3A基因相對表達水平，利用2-△△Ct法計算UBE3A相對表達水平，篩選干擾效率最高的干擾片段。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達 各組細胞轉(zhuǎn)染72 h后，提取各組細胞總蛋白并進行蛋白定量，計算含20 μg蛋白的溶液的體積為上樣量，按常規(guī)進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉，加入一抗4 ℃過夜，再次洗膜后孵育二抗1 h，BeyoECL Plus試劑盒顯色及成像，以β-actin為內(nèi)對照，使用凝膠圖像軟件Image Lab數(shù)據(jù)分析。

1.4.6 CCK8法檢測UBE3A細胞增殖 分別于轉(zhuǎn)染 24、48、72 h后每孔加入 CCK8試劑 10 μL，于培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標儀選擇450 nm波長測定吸光度值，根據(jù)吸光度值分析細胞增值情況；每次取5個復孔，重復3次。

1.4.7 Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 取生長良好處于對數(shù)期的細胞，消化后調(diào)整細胞密度至2×104/mL；取細胞懸液200 μL加入Transwell上室，下室加入500 μL含10%的FBS培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，后用1%的結(jié)晶紫染色微孔膜下室的細胞10 min，PBS輕輕沖洗干凈后稍微晾干，于倒置顯微鏡觀察。每組10個高倍視野觀察通過Transwell小室的MDA-MB-231細胞數(shù)量，以反映腫瘤細胞的體外侵襲能力的大小。

1.4.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期情況 取生長良好的各組細胞，制成單個細胞懸液;離心收集細胞，加入3 mL預冷（-20 ℃）70%乙醇到細胞沉淀中，重懸細胞，于4 ℃固定過夜；再次離心收集細胞，用PBS洗細胞2次后離心收集細胞，加入500 μL PBS 含 50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2%Triton X-100，于4 ℃避光孵育30 min；調(diào)整細胞密度，設(shè)置參數(shù)，上機檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；使用Graphpad 7對結(jié)果進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 shRNA載體陽性克隆測序結(jié)果

將設(shè)計合成的UBE3A靶點序列在基因組數(shù)據(jù)庫進行對比，未發(fā)現(xiàn)該序列與其它編碼同源，且重組質(zhì)粒經(jīng)過測序分析驗證，與預期序列相符。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率

根據(jù)同一視野下白光和熒光細胞數(shù)目如圖1，干擾組轉(zhuǎn)染率均在95%以上，可進行后續(xù)基因功能實驗。

2.3 最有效干擾片段的篩選

慢病毒轉(zhuǎn)染細胞48 h后，提取各組細胞總RNA，應用qRT-PCR檢測UBE3A及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA，獲得各組細胞的擴增曲線及各組細胞UBE3A及GAPDH的Ct值，利用溶解曲線判斷PCR產(chǎn)物的特異性。以GAPDH進行標化，使用2-△△Ct法分析各基因的Ct值，2-△△Ct值即為基因的相對表達量。以空白對照組為參考比較，其中陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（t=1.861，P=0.136）；3個干擾組差異均有統(tǒng)計學意義（干擾序列1：t=18.907，P=0.000046；干擾序列2：t=0.196，P=0.00000517；干擾序列3：t=71.925，P=0.00000293），其中，干擾序列3的干擾效率較高，達89.5%，故采用干擾序列3序列進行后續(xù)實驗（圖2）。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的MDA-MB-231細胞（同一視野，×50） A：普通光學顯微鏡下；B:熒光顯微鏡下Figure1 MDA-MB-231 cells 48 h after lentiviral transfection (the same field of view, ×50) A: Under light microscope; B: Under fluorescence microscope

圖2 各組MDA-MB-231細胞UBE3A mRNA相對表達量Figure2 The relative mRNA expression levels in each group of cells

2.4 干擾后UBE3A蛋白的相對表達水平

病毒感染細胞72 h后，提取各組細胞總蛋白檢，檢測UBE3A蛋白的相對表達水平，結(jié)果見圖3，以Image J進行灰度分析和標化。陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），干擾組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.488，P=0.010），其相對表達量為54.7%，抑制率為45.3%，可進行后續(xù)實驗。

圖3 Western blot檢測UBE3A蛋白的相對表達水平Figure3 The relative mRNA expression levels determined by Western blot

2.5 Transwell檢測MDA-MB-231細胞的侵襲能力

Transwell實驗結(jié)果顯示，陰性對照組與空白對照組的侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），干擾組與空白對照組相比，侵襲細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.450，P=0.000）（圖4）。

圖4 Transwell檢測各組細胞侵襲能力Figure4 Cell invasion abilities detected by Transwell assay

2.6 細胞增殖能力的變化

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，測各組450 nm處OD值，陰性對照組與空白對照組相比，各時間點差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；干擾組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t24h=2.314，P=0.039；t48h=3.498，P=0.008；t72h=7.657，P=0.000）（圖5）。

圖5 各組細胞各時間點OD值Figure5 OD values of each group of cells at different time points

2.7 細胞周期的變化

轉(zhuǎn)染48 h后進行流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期，3組細胞在各個周期差異均有統(tǒng)計學意義（G0/G1期：F=243.712，P=0.000；G2/M期：F=29.804，P=0.001；S期：F=252.522，P=0.000）。其中陰性對照組與空白對照組在細胞周期各時期差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；干擾組與空白對照組比較，各時期差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），干擾UBE3A后，MDAMB-231細胞大多數(shù)處于S期（圖6）。

圖6 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期Figure6 Cell cycles of each group of cells examined by flow cytometry

3 討 論

蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，正常機體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生與降解維持著動態(tài)平衡。其產(chǎn)生受基因調(diào)控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和UPS，后者具有高度選擇性[2]，正因為如此，有越來越多的藥物針對UPS系統(tǒng)作為治療靶標[3-4,10]，比如bortezomib和carfilzomib靶向藥物。UPS由泛素（UB）、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素蛋白連接酶E3、泛素延長酶E4、去泛素化酶DUB（DUB）和26S的蛋白酶體組成。到目前為止，發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種E1酶，約30種的E2酶，約600種E3酶[1]。在UPS中由于E3酶獨特的結(jié)構(gòu)和功能域，決定了其介導的靶蛋白降解反應的高度選擇性與特異性。UBE3A又稱E6-AP（E6 associated protein，E6-AP），屬于含有HECT結(jié)構(gòu)的E3泛素蛋白連接酶家族成員。UBE3A基因可編碼5種mRNA，最終編碼3種同分異構(gòu)體的蛋白亞型[11]。每一種亞型的具體功能現(xiàn)在還不完全清楚。目前的研究[12-13]表明，UBE3A蛋白定位在細胞核中，作為甾醇類激素受體的共激活因子調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄參與天使綜合征（Angelic Syndrome，AS），研究[5,14-19]證實，細胞內(nèi)大量的基因編碼的蛋白質(zhì)如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本次選取乳腺癌細胞株MDA-MB-231來源于三陰性乳腺癌患者，惡性程度較高，具有較強的侵襲能力。本實驗首先以UBE3A基因為靶標，按照RNAi原則設(shè)計出3條siRNA和1條陰性對照，按照小干擾片段設(shè)計合成shRNA表達載體，同時使用慢病毒介導轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞，以此來增加轉(zhuǎn)染效率。

細胞的增殖是活細胞在行使各種生理功能時重要的生物學特征之一，是生物體新陳代謝的表現(xiàn)，是生物體遺傳、分裂繁殖、生長、發(fā)育的基礎(chǔ)[20]。細胞的增殖周期即指細胞從一次分裂結(jié)束開始生長，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個過程，可分為間期和分裂期。間期又可分為G0期（休眠期）、G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）。因此如果阻斷某些蛋白的合成如組蛋白、微管蛋白等，細胞將停止間期而不能進入有絲分裂，從而影響細胞周期[20]。

本實驗通過慢病毒介導轉(zhuǎn)染，成功下調(diào)乳腺癌細胞MDA-MB-231 UBE3A基因及蛋白的表達。下調(diào)UBE3A后乳腺癌細胞的增殖能力較空白組及陰性對照組受到抑制，這也應證了前期Zhou等[7]和侯令密等[8-9]的研究結(jié)果，且下調(diào)UBE3A表達后的乳腺癌細胞與對照組相比較，多的處于S期，即DNA合成期。換言之，下調(diào)UBE3A的細胞無法正常進入分裂期，從而顯示出較低的增值能力。同時在Transwell小室侵襲實驗中顯示，下調(diào)UBE3A表達后，細胞的侵襲能力降低。這可能是因為UBE3A作為UPS中關(guān)鍵酶之一降解細胞周期相關(guān)的的蛋白，參與了基因的調(diào)控，抑制了DNA的合成，從而使下調(diào)UBE3A后的乳腺癌細胞較多的處于S期，顯示出較低的增值能力[21-22]；還可能是因為下調(diào)UBE3A后乳腺癌細胞內(nèi)某些信號通路發(fā)生改變[23-24]，或者某些抑癌基因未受到UBE3A介導的蛋白降解[5,21,25]，致使乳腺癌細胞侵襲能力減弱。

總之，下調(diào)UBE3A表達后，三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的增殖能力、細胞周期以及細胞的侵襲能力等生物學行為發(fā)生變化，提示UBE3A在三陰性乳腺癌細胞中扮演著重要角色，其可能是三陰性乳腺癌治療的一個潛在靶標。當然其具體參與機制還有待進一步的研究。

下調(diào)UBE3A表達后，三陰性乳腺癌細胞MDAMB-231的增殖能力降低、侵襲能力降低以及細胞周期發(fā)生變化，提示UBE3A在三陰性乳腺癌細胞中扮演著重要角色，其可能是乳腺癌治療的一個潛在靶標。