王芳芳 白寶寶 曾 迪 楚 軼 李 雪

中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710038

目前，心血管疾病，尤其是心肌缺血所導(dǎo)致的大量功能性心肌細(xì)胞死亡、損傷等，已成為威脅人類健康的首要殺手[1-3]。研究顯示，自我更新和多向分化的干細(xì)胞能夠分化再生成心肌細(xì)胞，這為心血管疾病的治療帶來了新的希望[4-7]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），可從自體細(xì)胞逆分化獲得，在避免倫理學(xué)爭議的同時也解決了免疫排斥反應(yīng)等難題[8-10]。然而，iPSC定向誘導(dǎo)分化目前還存在著靶細(xì)胞定向分化效率不高、分化機制尚未明確、靶細(xì)胞功能未趨向成熟等問題，阻礙了其在心肌組織工程再生中的應(yīng)用。

microRNA（miRNA）是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，但不負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)，其序列高度保守，生物功能較廣。其通過降解mRNA抑制蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、遷移、凋亡及組織發(fā)育。大量實驗表明，已有40余種miRNA參與調(diào)控心肌生理和病理活動，其中miRNA-1和miRNA-133已被證實參與了胚胎期心肌生成及發(fā)育過程，且在肌組織中表達(dá)豐富。本研究旨在為進(jìn)一步研究miRNA-1和miRNA-133在調(diào)控iPSC定向分化為心肌細(xì)胞過程中的作用，為促使iPSC更有效地向心肌細(xì)胞定向分化提供更為可靠的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

美國國家癌癥研究所（ICR）孕鼠來源自解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物中心，2周齡，10只，體重 9～12 g，合格證號 SCXK（陜）2017-0002，使用許可證號20170611。適應(yīng)性飼養(yǎng)條件：配置好飼料、飲水、墊料，做好通風(fēng)，12 h/12 h明暗交替，溫度26℃，濕度50%～70%。iPSC購自中科院實驗中心；miRNA-mimic、miRNA-1mimic、miRNA-133amimic購自德國 miScript；所有細(xì)胞培養(yǎng)基及血清均購自Invitrogen公司。OpenArray?實時熒光定量PCR、Invitrogen E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)購自法國Vilber Lourmat；CKX41倒置相差顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)均購自奧林巴斯公司。本研究已得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意及動物倫理批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的前期培養(yǎng) 取2周齡ICR孕鼠胚胎，加入含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶（0.5 g/L）進(jìn)行消化接種，傳代3代后利用絲裂霉素處理，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（miPSC）的培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的miPSC，并接種于絲裂霉素處理后的胚胎成纖維細(xì)胞上，接種密度為0.5×106個/皿，37℃孵育。觀察細(xì)胞的生長情況，定期更換培養(yǎng)液。將來源于胚胎成纖維細(xì)胞上的miPSC進(jìn)行消化傳代，種于8.7 μg/cm2Matrigel覆蓋的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)2 d，除去飼養(yǎng)層細(xì)胞；再次消化，以2×106個/mL的密度重懸于iPSC培養(yǎng)基，種于1 g/L明膠覆蓋的培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃孵育至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿80%的范圍；更換培養(yǎng)基為miPSC分化培養(yǎng)基。

1.2.3 miPSC的miRNA轉(zhuǎn)染及分化效率的檢測 利用LipofectamineTM2000方法，在利用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的miPSC細(xì)胞中分別加入對照miRNA（U6）（記為對照組）、miRNA-1（10 nmol/L，記為 miRNA-1 組）、miRNA-133（10 nmol/L，記為 miRNA-133組）及 miRNA-1和miRNA-133（分別為 10 nmol/L，記為 miRNA-1+133 組），轉(zhuǎn)染24 h后PBS洗滌，觀察每日miPSC的分化情況，采用CKX41倒置相差顯微鏡10倍觀察miPSC形態(tài)學(xué)特征，捕獲出現(xiàn)跳動的心肌合胞體的數(shù)量，計算細(xì)胞博動率并以細(xì)胞搏動率評判分化效率，兩者趨勢一致。細(xì)胞搏動率（%）=搏動群落數(shù)/細(xì)胞群落總數(shù)×100%，重復(fù)3次，取平均值

1.2.4 RT-PCR檢測miPSC的miRNA-1、miRNA-133及心肌肌鈣蛋白（cTnT）表達(dá) 收集miPSC細(xì)胞，提取總 RNA，以總體積 20 μL、RNA 樣品 1 μg的體系，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（參照試劑盒進(jìn)行），利用RT-PCR測定 miRNA-1、miRNA-133和 cTnT的表達(dá)。RTPCR 反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，PCR上下游引物各 1.0 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 6.2 μL。引物序列：cTnT的正向引物序列為5′-CAGAGGAGGC CAACGTAGAAG-3′，反向引物序列為 5′-TCGATCAGAGTCTGTAGCTCATT-3′；GADPH的正向引物序列為 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCT-3′，反向引物序列為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAG-3′；miRNA-1 的正向引物序列為 5′-TACACCATGGCAACGTAGAAT-3′，反向引物序列為 5′-ATGTGGTACCGTCGCATCTTA-3′；miRNA-133的正向引物序列為5′-CACCAGACCAGAGGCAGATG-3′，反向引物序列為5′-GTGGTCTGGTCTCCGTCTAC-3′；miRNA（U6）的正向引物序列為 5′-CACAGGATTCCGGCGTGGAG-3′，反向引物序列為 5′-GTGTCCTAAGGCCGCACCTC-3′。顯示的結(jié)果為與miRNA（U6）相比的相對值（以 2-ΔΔCt法進(jìn)行計算分析）。PCR引物序列由赫澎（上海）生物科技有限公司提供。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miPSC形態(tài)學(xué)特征

miPSC細(xì)胞形態(tài)為呈集落突起狀的卵/橢圓形，集落邊緣光滑，細(xì)胞排列緊密，增殖較快，倍增時間較短。隨著細(xì)胞的不斷分化及陸續(xù)平鋪，聚集成團(tuán)，團(tuán)塊邊緣衍生出梭形或多邊形細(xì)胞，并交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞團(tuán)/細(xì)胞簇。見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下miPSC形態(tài)學(xué)特征（10×）

2.2 各組miRNA-1、miRNA-133轉(zhuǎn)染效率比較

與對照組比較，miRNA-1組及miRNA-1+133組的 miRNA-1相對表達(dá)量升高，miRNA-133組及miRNA-1+133組的miRNA-133相對表達(dá)量升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組miRNA-1、miRNA-133轉(zhuǎn)染效率比較（n=3）

2.3 不同分化時間下cTnT在miPSC中的相對表達(dá)量變化

未分化的miPSC中較少表達(dá)cTnT，與分化0 d時比較，分化5 d后miRNA-1組及miRNA-133組內(nèi)cTnT的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而在分化10 d時升高更明顯（P ＜ 0.01）。分化 10 d時，miRNA-1+133組 cTnT表達(dá)水平較miRNA-1組及miRNA-133組更高（P＜0.01）。 見圖 3。

2.4 過表達(dá)miRNA-1和miRNA-133對miPSC分化效率的影響

圖3 不同分化時間下cTnT在miPSC中的相對表達(dá)量變化（n=3）

與對照組比較，miRNA-1組及miRNA-133組細(xì)胞搏動率無變化（P＞0.05），miRNA-1+133組搏動率顯著提高（P＜0.01）。見圖4。

3 討論

miRNA作為一類非編碼的短鏈RNA，長度為18～22 nt，能夠結(jié)合基因的3′UTR來進(jìn)行靶基因mRNA的翻譯調(diào)控[11-13]。資料顯示，許多miRNA在心肌細(xì)胞分化、心臟發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，miRNA-1、miRNA-133尤甚，其在肌肉組織中的表達(dá)具有高豐度特點，在心臟發(fā)育、心律失常、心肌肥厚等心臟生理病理過程中發(fā)揮作用，且miRNA-1和miRNA-133作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子參與干細(xì)胞分化形成心肌的過程[14-17]。miRNA-1和miRNA-133隸屬同一基因簇，在受血清應(yīng)答因子、成肌分化因子等調(diào)控特異miRNAs的過程中均有表達(dá)且可以同時被轉(zhuǎn)錄，但miRNA-1和miRNA-133功能截然不同，前者是加速成肌細(xì)胞分化，抑制其增殖；后者相反，兩者平衡存在。

圖4 過表達(dá)miRNA-1和miRNA-133對miPSC分化效率的影響（n=3）

iPSC具有強大的增殖能力及分化能力，利用iPSC技術(shù)可獲得患者或者疾病所需的特異多能干細(xì)胞，減少免疫排斥反應(yīng)[18]。但目前iPSC在心肌定向分化、心肌再生領(lǐng)域中的研究尚不成熟[19-21]。本研究結(jié)果顯示，未分化的miPSC較少表達(dá)cTnT，分化5 d后miRNA-1組及miRNA-133組內(nèi)cTnT的表達(dá)明顯升高，而在分化10 d時升高更明顯，且miRNA-1+133組中cTnT表達(dá)水平較miRNA-1組及miRNA-133組更高；另外，單獨過表達(dá)miRNA-1和miRNA-133，細(xì)胞分化效率及細(xì)胞搏動率未見增長；但過表達(dá)miRNA-1+133后，搏動率顯著提高，提示二者可能在促進(jìn)miPSC向心肌分化的過程中存在協(xié)同作用，可能與二者同時過表達(dá)后誘導(dǎo)分化形成的心肌細(xì)胞骨架更明顯、形態(tài)更伸展、細(xì)胞結(jié)構(gòu)更成熟、分化效率更高等有關(guān)。Takaya 等[22]提出，miRNA-1、miRNA-133 參 與 胚 胎細(xì)胞二維分化，與本研究觀點有所不同，原因可能是本研究采用的是成纖維細(xì)胞，具體機制還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，miRNA-1與miRNA-133單獨作用對心肌分化無促進(jìn)作用，但共表達(dá)miRNA-1和miRNA-133后，可顯著提高miPSCs向心肌細(xì)胞定向分化的效率，這一過程可能是通過協(xié)同作用來完成的。本研究為揭示miPSCs分化過程中miRNA-1和miRNA-133的協(xié)同分子機制研究提供了實驗基礎(chǔ)。